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文檔簡介
1、3 6 0福 建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2 0 0 5 年 1 O月 第 3 9卷第 4期 L e wi s大鼠 骨 髓 間充 質(zhì) 千 細(xì) 胞分 離 培 養(yǎng)和 鑒 定 鄭輝 哲 ,林 群 ,雷立 華 ,楊 進(jìn) ,韓 濤 摘要:目的 建 立從 L e w i s 大 鼠骨髓 中分離 、 培養(yǎng) 間充質(zhì)干細(xì)胞 的方 法, 并對分 離、 培 養(yǎng)的 間充質(zhì)干細(xì) 胞進(jìn) 行鑒定。方法 采用 P e r c o 1 1 ( 1 . 0 7 3g / L
2、) 密度梯度分離和貼壁培 養(yǎng)相結(jié)合 的方法 分離 培養(yǎng) L e w i s 大 鼠 的骨 髓間 充質(zhì)干細(xì)胞 ( MS C ) 。M S C細(xì)胞鑒定 : 采用相差顯微鏡觀察 M S C的形態(tài)學(xué)特 征 ; 流式細(xì)胞儀 檢測細(xì)胞表面標(biāo)志抗原 C D 2 9 , C D g 0 , c D 3 4 和 C D 4 5 的表達(dá) 率 ; 蘇丹 Ⅳ染色 檢測 MS C成脂 細(xì)胞分化 ; 堿性 磷酸酶 染色 和茜 素紅染 色檢測 MS C成骨分化。結(jié)果
3、 原代培養(yǎng) 的 MS C于 2 4h后貼壁 , 4 8 ~7 2h形成集落, 1 2 ~1 5d 可 達(dá)到 8 O %~9 O %融合 。第 1代細(xì)胞表面標(biāo)記物 C D 2 9 , c D 9 0 , C D 3 4 和 C D 4 5 的陽性率分 別為 8 O . 4 1 %, 6 6 . 2 7 %, 2 . 7 3 %, 0 . 7 4 %。第 3 代 細(xì)胞表面 標(biāo)記物 c D 2 9 , c D 9 0 , C I : h 4
4、和 C D 4 5 的陽性率分別 為 8 9 . 9 1 %, 8 8 . 1 7 %, 0 . 8 1 %, 0 . 1 7 %。細(xì)胞周期 分析顯示 , 第 5 代 細(xì)胞 G 0 / G l 期細(xì)胞占 6 8 . 9 %, S + G 2 + M 期 為 3 1 . 1 %。用 a — ME M培養(yǎng) 液培養(yǎng) 的第 6 代 細(xì)胞部 分分化 為成骨和成脂 細(xì)胞。結(jié)論 采 用 P e r c o l l ( 1 . 0 7 3g / L )
5、 密度 梯 度分 離 和貼 壁培 養(yǎng) 相 結(jié)合 的方 法 能夠 成 功 分離 和 培養(yǎng) 大 鼠的 MS C 。第 5代 MS C細(xì)胞保 持分化潛能 。關(guān)鍵詞 : 大 鼠,近交 L e w;細(xì)胞分離 ;細(xì)胞培養(yǎng) ; 干細(xì)胞 ;骨髓細(xì)胞 ; 細(xì)胞周期 ; 細(xì)胞分化 中圖分類號 : R 3 2 9 . 2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 : A文章 編號 : 1 6 7 2 — 4 1 9 4 ( 2 0 0 5 ) 0 4 — 0 3 6 0 — 0 4骨 髓
6、間 充質(zhì) 干 細(xì) 胞 ( MS C) 移 植 治 療 心肌 梗 死 的研究常選用近交系 L e w i s 大 鼠為實(shí)驗(yàn)對象, 以減 少異體移植排斥反應(yīng)和建立穩(wěn)定 的心肌梗死模型。筆者擬從近交系 L e w i s 大鼠的骨髓分離 、 培養(yǎng)、 擴(kuò)增 MS C , 流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo) 記物, 并促進(jìn)其 向成 骨及成脂細(xì)胞分 化來獲得 進(jìn)一步證 實(shí), 了解 MS C的增殖特性, 為后續(xù)的 MS C移植 治療心肌梗死 的 研究 奠定基 礎(chǔ)
7、。1 材料與方法 1 . 1 動物 S P F級 雄性 L e wi s 大 鼠 ( 4周 鼠齡 , 1 2 0g 左右) 。由北京維通 利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司 提供 ( 北京 市實(shí)驗(yàn) 動 物質(zhì) 量合 格證 : 0 0 3 1 4 9 2 ) 。1 . 2 主要試劑和藥 品a — ME M 培養(yǎng)基 ( G i b c o 公 司 ) , D ME M— L G 培 養(yǎng) 基 ( Gi b e o公 司 ) , P e r e o 1 1
8、 分 離 液( P h a r m a e i a 公司) , 胎牛血清( 杭 州四季青生物工 程材 料有 限公 司 ) , 青 、 鏈 霉 素 ( S ea 公 司) , 胰 酶 ( A mr e s c o公 司 ) ,乙二 胺 四 乙 酸 ( E D T A, Gi b c o公 司 ) , 茜 素 紅 ( S i g ma 公 司 ) , 蘇 丹 Ⅳ醇 ( S i g ma公 司 ) ,D NA分 析試 劑盒 ( C o u l
9、 t e r 公 司 ) , 倉 鼠抗 大 鼠一 c I : h 。 一F I T C ( P h a r Mi n g e n公 司) , 小 鼠抗大 鼠一 C D 4一 F I T C( C a l t a g e 公 司) , 小 鼠抗大 鼠一 C D 9 0 一 F I T C ( C a l t a g e 公 司) , 小鼠抗大鼠一 C D 3 4 一 P E ( S 眥 aC r O z 公司) 。收稿 日期: 2 0 0
10、 5 . 0 4 . 0 5修回 日期 : 2 0 0 5 — 0 7 . 1 4基金項 目: 福建省教育廳科研基金資助項 目( J B 0 4 2 1 1 )作者單位: 1 . 福建省腫瘤醫(yī)院 麻醉科 , 福州 3 5 0 0 1 42 . 福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第一 醫(yī)院 麻醉科 。 福 州 3 5 0 0 0 53 . 福建省立醫(yī)院 心血管 研究所 心外科 。 福州 3 5 0 0 0 14 . 福建醫(yī)科大學(xué) 附屬 口腔醫(yī)院種植 中心
11、, 福州 3 5 0 0 0 2作者簡介 : 鄭輝哲 ( 1 9 7 1 ~) , 男, 主治 醫(yī)師 。 醫(yī)學(xué)碩士 .1 . 3 原代大 鼠 MS C分離培 養(yǎng) 采用離心分離和 貼壁培養(yǎng)法nJ 。處死大 鼠, 無菌條 件下獲取雙側(cè) 股骨和脛骨。用 D ME M— L G培養(yǎng)液( 每 1 0mL含肝 素 5 0mg ) 沖 出骨 髓 , 充 分 吹 打 混 勻 后 制 成 4×1 0m L -懸液。將細(xì)胞懸液緩慢地疊加到預(yù)先裝有
12、等量 P e r c o l 1 分 離 液 ( 1 . 0 7 3g / L ) 的離 心 管上 層, 11 0 0r / mi n 離 心 3 0mi n , 收取 位 于分 離介 質(zhì)之 間的單個 核 細(xì)胞。P B S洗滌兩 遍, 加 入 D ME M— L G全培 養(yǎng)液 ( 含 1 0 %胎牛血 清, 1 0 0u / mL青霉 素, 1 0 0u / m L鏈 霉素 ) , 以 1 . 5×1 0c m的密 度 接種
13、于 培養(yǎng) 瓶 中,在 3 7℃、 體積分?jǐn)?shù)為 0 . 0 5的飽和濕度 培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng), 2 4 和 7 2h 后各換 液一次, 去 除非 貼壁細(xì)胞。 以后每 3 ~4d 換液 1 次。細(xì)胞生長達(dá)到 8 0 %~9 0 %融合 時, 用 0 . 0 5 %胰 酶 +0 . 0 2 % 乙二 胺 四 乙酸 ( E D T A ) 消化, 1 : 3 傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。1 . 4 細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測 0 . 2 5 %胰酶 + 0 . 0 2
14、%E D T A消化收獲第 1 代和第 3 代 細(xì)胞, 與飽和濃度 的 抗 C I : h 9 一 F I TC 、 C D 4 5 一 F I T C、 C D 3 4 一 P E、 C D 9 0 一 F I T C單克隆抗體及 其同型對照混勻, 室溫下閉光反應(yīng) 2 0mi n , P B S洗 滌 細(xì) 胞 , 行 流 式 細(xì) 胞 儀 檢 測 , E X P O 3 2 .V1 . 2軟件分析。1 . 5 促進(jìn) MS C向成骨和成脂
15、細(xì)胞分化 取第 6 代 細(xì)胞 , 換為 含 1 0 %胎牛血清 的 a — M E M 培養(yǎng)液, 每 6 -7d換液, 讓 細(xì)胞處于半饑餓狀態(tài), 用倒置相差 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化, 2 0d后分別行茜 素紅染 色 顯 示 是 否 鈣 鹽 沉 積 , A KP染 色 顯 示 是 否 產(chǎn) 生 A K P和蘇丹 Ⅳ醇染色有否 出現(xiàn)脂肪 ; 用正常培養(yǎng)的 第 4 代細(xì)胞做對照。維普資訊 http://www.cqvip.com 口A 鈣化結(jié)節(jié)
16、; B 鈣化蛄[ 船. 見 自搿塊圉 3ME M 培 養(yǎng)彼 培養(yǎng) 1 5d的第 6 代 骨髓 1充質(zhì)干 細(xì) 胞( x2 0 0 )圖 4ME M 培養(yǎng) 掖培 養(yǎng) 1 5d的筇 6 代 骨 髓問克藤 干細(xì) 眥 . A K P船 色陽 性 ( ×2 0 0 )A胞質(zhì)有脂墑沉著 . B月w染I圖 5nME M 培 養(yǎng)漬 培 _ 蕎 的 第6 代 骨髓 刨充 質(zhì)干 細(xì)胞 ( x2 0 0 )24 細(xì) 胞增殖周期 ( 圈 6 )第5
17、代細(xì) 胞/ G , 期細(xì) 胞 占 6 89 %S 十 G 2 + M 期 為 3 11 %二倍 體細(xì)胞 占總數(shù) 8 43 %, 其 中 G 0 / G I 期細(xì) 胞 為 7 7 . 4 %. S 十G 2 + M 期 為 2 2 . 6 %異 倍體 封 Ⅱ 胞 占總 數(shù) 1 57 %.其中 G o / G 1 期 細(xì)胞 為 2 3 %, S + G 2 +M 期 為 7 7 %,D NA 指 數(shù) ( D I )1 . 7 7 7由 于骨
18、 髓的細(xì) 胞組成復(fù) 雜. 細(xì) 胞功能 各異. 萁中幅建 醫(yī)科 大 學(xué)學(xué) l 報 2 0 0 5年 l 0 月 第 3 9 卷第 4 期 囂%sPmLc ” 。T0”6 41 2 8 【 9 22 5 63 2 03 8 44 4851 2圈6 第5 代 目倚問 充質(zhì) J . 細(xì) 胞 增殖周 期 曲線 MS C含量 很低 , 約為骨 髓低密 度組分 中有核 細(xì)胞的 0 . 0 0 1 %~00 1 %. 故分離高 純 度的 M S C是
19、原 代培 養(yǎng)關(guān)鍵 性技 術(shù)¨】 。筆者 采 用Pc 0 n 密度 梯度 分離 和 貼壁培養(yǎng)相 結(jié)合的方 法, 即利 用 P e r c Q t [ 將大 部分 造 血細(xì)胞 和單個核 細(xì)胞分 離, 經(jīng)過 體 外貼壁 培養(yǎng)換 液 擊除懸 浮生 長的 造血 干 細(xì)胞 . 分離 獲得 MS C 的純 度達(dá)到 9 0 %左右 . 與 P i t t e n g e 等報道 相近 J 。間充 質(zhì)干細(xì)胞 沒有特 異性 表 面抗原 , 但
20、研究發(fā) 現(xiàn)問充質(zhì) 干細(xì)胞有 如下特 點(diǎn) : 不表 達(dá) c、 C5 , 而只表達(dá) C D 2 9C D 4 4 、 Cl 、 C D 9 0 等基質(zhì) 細(xì)胞 和問質(zhì) 細(xì)胞柏特異 ’ 睦表面標(biāo) 志抗原 】卒 研究選 擇 rC D 2 9 、C O 9 0 、 C D和 C D 4 5 進(jìn) 行檢 測。 結(jié)果 表明, 培 養(yǎng)的 細(xì)咆 c9 和 c D 9 0 陽性 , C D和 c5 陰 住, 符合 MS C的特點(diǎn) 。同時表 明. 第 3 代 M
21、 S C的 CC D 的陽性率和 C DC D 4的陰性 率 比第 1 代高, 提 示 MS C的連綞培 養(yǎng)是其不 斷純化 的過程 由 于 可 充質(zhì)千 細(xì)胞 沒有 特異 性表 面抗體 , 救 其鑒定仍 是一個 難躕 。目前. MS C 鑒定方 法都是 通過 在培養(yǎng)過 程 中出現(xiàn)分 化表型 . 然后 逆推得 知是 否為MS C間充質(zhì) 干細(xì)胞 具有 多向分 化 潛能. 能分 化為成骨細(xì)胞 、 軟骨 細(xì)胞 及 脂腑 細(xì)胞J 。間充 質(zhì)干 細(xì)胞
22、還可能 具有可塑 性。 即 成體干 細(xì)胞 能產(chǎn) 生與它 存在部位組 織不 同的其他 組織類 型特 異 細(xì)胞, 有些 研究認(rèn)為 , 問充 質(zhì)干細(xì)胞 能誘導(dǎo)分 化為心肌 細(xì)胞 、 神經(jīng)細(xì)胞等 1 。但是 , 關(guān)于 成體 于 細(xì)胞 是否 縣有 可塑 性還存在很 大爭議 , 有 一種 觀點(diǎn) 認(rèn)為 可塑性 是細(xì)胞 融合的喪象 J 。所 以, 筆者 選擇 在體 外促進(jìn) 所 培養(yǎng) 的細(xì) 咆向成骨 細(xì)胞和 成脂 細(xì)咆 分化 的方法 來逆推 。研究結(jié)
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