DNA脫甲基化對整合至rDNA區(qū)外源基因hFⅧ表達量的影響.pdf

1、DNA甲基化作為一種基因表達調(diào)節(jié)機制，在許多生物學過程中扮演著重要的角色，包括胚胎發(fā)育、遺傳印記、細胞分化和腫瘤發(fā)生等。pHrneo是被我室構(gòu)建的一種人類核糖體DNA打靶載體。它能靶向外源基因到人類核糖體DNA區(qū)。由pHrneo攜帶的外源基因能穩(wěn)定地在多種細胞中表達，包括HL7702(人類肝細胞)和HT1080(人類纖維肉瘤細胞)，但是，其表達效率有待于進一步提高。影響定點整合目的基因表達的因素可能有多種，包括目的基因的拷貝數(shù)、DNA甲

2、基化修飾、組蛋白的乙?；揎椀取＿@里我們從DNA甲基化修飾的角度，探究其對定點整合目的基因表達的影響。 目的：通過比較脫甲基化藥物5-aza-2’-deoxycytidine處理組和對照組定點整合克隆細胞株目的基因人凝血因子Ⅷ的表達情況，以及目的基因CMV啟動子區(qū)甲基化情況，研究DNA甲基化對目的基因表達的影響。 方法：我們選擇三種不同濃度的脫甲基化藥物5-aza-2’-deoxycitidine-5μM、10μM、20

3、μM，分別對pHrneoSK39-25細胞株處理72小時和120小時，同時以未加脫甲基化藥物處理的定點整合克隆細胞株、脫甲基化藥物處理的HT1080細胞株和相同條件下未處理細胞的同濃度的脫甲基化藥物為對照組。收集各組細胞上清，通過ELISA檢測各組hFⅧ的表達情況。此外，用重亞硫酸鹽測序PCR，確定CMV啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果：ELISA檢測各組目的基因表達情況顯示，用5-aza-2’deoxycytidine處理72小時