DNA甲基化對(duì)丹參酚酸類成分積累影響的研究.pdf

1、丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我國傳統(tǒng)中醫(yī)中常用藥物之一，是唇形科鼠尾草屬的多年生草本植物。丹參在心血管疾病治療以及抗氧化等方面都有顯著的效果。其主要的活性物質(zhì)可分為兩大類：一類為脂溶性的丹參酮類物質(zhì)，一類為水溶性的酚酸類物質(zhì)，它們具有很多種重要的藥理活性，特別是具有強(qiáng)大的抗氧化活性。DNA甲基化作為一種常見的主要的表觀遺傳修飾，是在不改變核苷酸序列的情況下，進(jìn)行DNA修飾，影響基因的表達(dá)，同時(shí)它也是重要的

2、環(huán)境應(yīng)激響應(yīng)。有研究表明，植物受到外界環(huán)境刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生差異DNA甲基化。因?yàn)榇紊x產(chǎn)物被認(rèn)為是植物在長期進(jìn)化中對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，在植物與生態(tài)環(huán)境的關(guān)系中扮演著非常重要的角色，但是，現(xiàn)在關(guān)于植物次生代謝和DNA甲基化關(guān)系的研究還非常的少，特別是有關(guān)于DNA甲基化調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的研究鮮有報(bào)道。本文以丹參毛狀根為材料，通過不同誘導(dǎo)子處理，檢測(cè)毛狀根生物量、有效成分含量、相關(guān)基因表達(dá)以及DNA甲基化情況，對(duì)丹參酚酸類物質(zhì)的生物

3、合成調(diào)控進(jìn)行部分探索，并推測(cè)DNA甲基化是否在植物次生代謝產(chǎn)生過程的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，具體研究如下：
　　1.葉酸對(duì)丹參毛狀根生長及酚酸類物質(zhì)積累的影響。方法：首先利用不同終濃度的葉酸（25、50、100、200μmol/L）處理丹參毛狀根，6天后檢測(cè)丹參毛狀根中酚酸類成分的含量，獲得最優(yōu)的處理濃度。根據(jù)此濃度處理丹參毛狀根，誘導(dǎo)1、2、4、6、9d后收集，檢測(cè)酚酸類物質(zhì)含量及相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果：1)50μM葉酸效果最明顯。

4、與對(duì)照相比，鮮重增加了41.3％，迷迭香酸、丹酚酸B和咖啡酸的含量最高值達(dá)到0.607mg/g、1.344mg/g和0.015mg/g，分別提高了97.6%、76.7%和77%。2)50μM葉酸誘導(dǎo)下，與對(duì)照組相比，咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B及總酚酸含量的增長率在第6天最高，分別被提高了19.8%、49.4%、43.7%和43.2%，咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B的產(chǎn)量在第6天分別被提高了37.7%、71.6%和65.1%。3）PAL和TA

5、T的表達(dá)在第一天迅速提升，分別達(dá)到了對(duì)照的26.6倍和3.4倍，然后它們的表達(dá)量漸漸隨著時(shí)間的推移而回落，直到第9天低于對(duì)照組。RAS作為迷迭香酸合成途徑下游的關(guān)鍵基因，研究結(jié)果表明RAS對(duì)于葉酸的響應(yīng)晚于PAL和TAT。RAS在誘導(dǎo)處理后第2天達(dá)到了最高表達(dá)量，是對(duì)照的21.9倍，同樣隨著時(shí)間的推移，表達(dá)水平慢慢回落。
　　2.5-AzaC和SAM對(duì)丹參毛狀根酚酸類物質(zhì)積累及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的研究。方法：利用不同終濃度的5-Az

6、aC（10、100、250、500μM）、SAM（1、10、100、1000μM）處理丹參毛狀根，獲得最優(yōu)的處理濃度后再處理丹參毛狀根，誘導(dǎo)1、2、3、6、9d后收集，檢測(cè)酚酸類物質(zhì)含量及酚酸合成相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果：1）10μM5-AzaC促進(jìn)效果最明顯，毛狀根鮮重增加了18.6%，迷迭香酸和丹酚酸B的含量最高值達(dá)到了0.732mg/g和1.544mg/g，分別提高了138.2%和103.2%；1000μM SAM抑制作用最明顯，毛狀根

7、的鮮重降低了28.1%，迷迭香酸的含量降低了72.6%，丹酚酸B的含量甚至降到90%以上。2）10μM5-AzaC誘導(dǎo)下，與對(duì)照相比，丹參素在第3天提高了20%，阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B在第6天分別提高了80%、62.3%、33%；1000μM SAM誘導(dǎo)下，阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B和肉桂酸在第6天分別降低了71.8%、78.6%、74.2%和65%。3）10μM5-AzaC：PAL、4CL、C4H、TAT、HPPR、CYP98A1

8、4、RAS表達(dá)水平均得到提升；1000μM SAM：PAL、4CL、C4H、TAT、HPPR、CYP98A14、RAS表達(dá)水平均受到抑制。
　　3.5-AzaC和SAM對(duì)甲基化基因表達(dá)與酚酸類合成基因啟動(dòng)子甲基化的調(diào)控研究。方法：利用熒光定量PCR檢測(cè)甲基相關(guān)基因的表達(dá)情況；利用亞硫酸鹽處理測(cè)序法檢測(cè)PAL、TAT的甲基化水平。結(jié)果：1）10μM5-AzaC：甲基化基因CMT、DEMETER、MET1、MET2、MET3、MET5

9、、MET6表達(dá)受到抑制，去甲基化相關(guān)基因MBD1、MBD2表達(dá)得到提升；1000μM SAM：甲基化基因CMT、DEMETER、MET1、MET2、MET3、MET5、MET6表達(dá)得到提升，去甲基化相關(guān)基因MBD1、MBD2表達(dá)受到抑制。2）檢測(cè)丹參PAL序列啟動(dòng)子內(nèi)的15個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況，5-AzaC處理后，其中5個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀況發(fā)生了改變；檢測(cè)丹參TAT序列啟動(dòng)子范圍內(nèi)11個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況，5-AzaC處理后