口腔鱗癌細(xì)胞中miRNA-222與CDKN1B(p27kip1)mRNA及靶蛋白表達(dá)關(guān)系的研究.pdf

1、目的：口腔鱗癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，約占頜面部惡性腫瘤的80％以上，在全身范圍的惡性腫瘤中居第八位[1]。近年來，口腔鱗癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。目前臨床上對口腔鱗癌的治療方法以手術(shù)擴(kuò)大切除為主，輔以放療、化療、生物治療、靶向治療、免疫治療等。雖然對于口腔鱗癌的治療手段實(shí)現(xiàn)多元化及精準(zhǔn)化，但因其易發(fā)生局部復(fù)發(fā)及淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移而影響口腔鱗癌患者的預(yù)后。

2、因此深入了解口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷及預(yù)后分析顯得十分迫切。研究證實(shí)多種原癌基因及抑癌基因的異常表達(dá)可能與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，長約18～23 nt。miRNA因其非編碼特性可在翻譯水平或者轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控一個(gè)或多個(gè)靶基因 mRNA及靶蛋白的表達(dá)水平［2］。CDKN1B（p27kip1）是近來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，其是細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制蛋白CDKI家族的最新成員，其與細(xì)胞周期關(guān)系密

3、切，可以阻斷細(xì)胞從G1期到S期。本研究通過對人舌鱗癌細(xì)胞株TCA-83瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-222模擬物及抑制物，同時(shí)設(shè)立陰性對照，分析其靶基因 CDKN1B（p27kip1） mRNA差異性表達(dá)及其靶蛋白在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)差異，探討miRNA-222對口腔鱗癌細(xì)胞中 CDKN1B（p27kip1）的靶向調(diào)控作用，以期對口腔鱗癌的早期發(fā)現(xiàn)、準(zhǔn)確診斷、靶向治療等提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1通過 Lipofecta

4、mineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將人工合成的 miRNA-222 mimics（miRNA-222上調(diào)組）和 inhibitor（miRNA-222下調(diào)組）轉(zhuǎn)染人舌鱗癌細(xì)胞株TCA-83，同時(shí)設(shè)立陰性對照組及空白對照組。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)（RT-PCR）分別檢測miRNA-222模擬物及抑制物轉(zhuǎn)染組及陰性對照組、空白對照組中 CDKN1B（p27kip1）基因 mRNA的表達(dá)量，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞中靶基因蛋白CDKN1B（p

5、27kip1）的表達(dá)情況。
　　2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，均經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布（P＞0.05），采用單因素方差分析（one-factor ANOVA）進(jìn)行組間兩兩比較， P＜0.05，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 RT-PCR檢測CDKN1B（p27kip1）mRNA的表達(dá)量
　　空白對照組（0.35±0.02）與mi

6、RNA-222 mimics轉(zhuǎn)染組（0.31±0.04）及 miRNA-222 inhibitor（0.40±0.01）轉(zhuǎn)染組相比較，P=0.031＜0.05， P=0.015＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；陰性對照組（0.35±0.03）與miRNA-222 mimics轉(zhuǎn)染組及miRNA-222 inhibitor轉(zhuǎn)染組相比較，P=0.037＜0.05，P=0.012＜0.05，miRNA-222 mimics轉(zhuǎn)染組與miRNA-22

7、2 inhibitor轉(zhuǎn)染組相比較，P=0.037＜0.05，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空白對照組與陰性對照組相比較，P=0.928＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2流式細(xì)胞術(shù)檢測CDKN1B（p27kip1）蛋白表達(dá)量
　　miRNA-222空白對照組其相應(yīng)門 X-mode值為8.0， FI=lg8.0×340=307.05；miRNA-222 mimics轉(zhuǎn)染組其相應(yīng)門X-mode值為5.4，F(xiàn)I=lg5.4×340=24

8、9.01；miRNA-222 inhibitor轉(zhuǎn)染組其相應(yīng)門X-mode值為13.4， FI=lg13.4×340=383.21。miRNA-222過表達(dá)時(shí)其CDKN1B（p27kip1）蛋白含量降低，反之，miRNA-222抑制后其p27kip1蛋白含量升高。
　　3人舌鱗癌細(xì)胞株TCA-83中miRNA-222對CDKN1B（p27kip1）的調(diào)控作用
　　miRNA-222過表達(dá)時(shí)其CDKN1B（p27kip1）mR

9、NA表達(dá)量為0.31±0.04，蛋白表達(dá)量FI=249.01，CDKN1B（p27kip1）mRNA及蛋白表達(dá)量較空白對照組及陰性對照組均降低，反之，miRNA-222抑制后其CDKN1B（p27kip1）mRNA（0.40±0.01）及蛋白表達(dá)量（FI=383.21）均較空白對照組及陰性對照組升高。
　　結(jié)論：
　　1脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染miRNA-222 mimics后可使人舌鱗癌細(xì)胞株TCA-83中miR-222過表達(dá)，反之