蛋白質(zhì)內(nèi)含子體內(nèi)定向進(jìn)化和切割、分段表達(dá)及體外剪接.pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子是位于蛋白質(zhì)前體內(nèi)的插入序列，其兩側(cè)的氨基酸序列稱為蛋白質(zhì)外顯子。在蛋白質(zhì)前體翻譯后成熟過(guò)程中，蛋白質(zhì)內(nèi)含子通過(guò)四個(gè)連續(xù)的親核置換反應(yīng)精確地從前體蛋白質(zhì)中自我切除，同時(shí)催化兩側(cè)蛋白質(zhì)外顯子以肽鍵相連產(chǎn)生成熟蛋白，這一過(guò)程稱為蛋白質(zhì)剪接。蛋白質(zhì)內(nèi)含子自主催化的反應(yīng)為蛋白質(zhì)合成和加工提供了新的途徑，因而在蛋白質(zhì)工程及其它領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 但是，在目前的研究中，仍然存在著大量未解決的問(wèn)題，如異源生物體內(nèi)剪接效

2、率低、蛋白質(zhì)內(nèi)含子純化系統(tǒng)效率低以及不能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)剪接人為控制等。針對(duì)以上問(wèn)題，本研究對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子進(jìn)行了如下改造：
　　 將卡那霉素抗性和蛋白質(zhì)剪接活性相結(jié)合，成功的在異源生物體內(nèi)構(gòu)建了依賴卡那霉素抗性的蛋白質(zhì)內(nèi)含子篩選系統(tǒng)。選擇TerThyX和Ssp DnaX兩個(gè)微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子對(duì)該篩選系統(tǒng)的可行性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：含有卡那霉素的平板上的菌落生長(zhǎng)情況與western blot檢測(cè)結(jié)果一致，證明本篩選系統(tǒng)完全可行。進(jìn)一步結(jié)合

3、定向進(jìn)化的策略，利用易錯(cuò)PCR，構(gòu)建菌落數(shù)超過(guò)106的突變庫(kù)，在抗性平板上獲得了4個(gè)高剪接活性的突變蛋白質(zhì)內(nèi)含子。Westernblot顯示：改造后的Ssp DnaX微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子在E.coli細(xì)胞內(nèi)剪接活性高于90％，真正解決了異源生物體內(nèi)剪接活性低的問(wèn)題。
　　 利用已獲得的高剪接活性的S1和S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Rma DnaB和Ssp GyrB，成功定點(diǎn)突變了N端或C端與剪接直接有關(guān)的保守位點(diǎn)的氨基酸，在E.coli

4、體內(nèi)將其改造為只有一端可發(fā)生斷裂，不能進(jìn)行完整的剪接作用的N端和C端切割元件。檢測(cè)改造后的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子一端切割的效率，篩選具高效切割活性的蛋白質(zhì)內(nèi)含子，以用于深入研究蛋白質(zhì)剪接機(jī)制，以及進(jìn)一步構(gòu)建高效的蛋白純化系統(tǒng)。
　　 將斷裂蛋白內(nèi)含子的N端和C端一小段多肽共同表達(dá)形成一個(gè)融合蛋白(NC蛋白)，同時(shí)在另一系統(tǒng)中表達(dá)intein中間片段(IM蛋白)，成功構(gòu)建了Rma DnaB和Ssp GyrB的NC融合蛋白和IM蛋白。分別

5、純化NC和IM蛋白后，在16℃，25℃，37℃條件下進(jìn)行體外剪接反應(yīng)，從而達(dá)到輔助斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子兩端二聚化的目的。通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，解開IN和IC特異性結(jié)合之謎。
　　 通過(guò)本論文的研究，在蛋白質(zhì)內(nèi)含子高級(jí)結(jié)構(gòu)未知的情況下，篩選獲得高剪接活性的蛋白質(zhì)內(nèi)含子，完成了對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子功能的進(jìn)化。并實(shí)現(xiàn)了斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的空間隔離，這對(duì)多個(gè)蛋白質(zhì)片段的體外連接具有重要的指導(dǎo)作用，并為研究蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接過(guò)程的可控性奠定理論基礎(chǔ)。隨著對(duì)