內(nèi)含子介導(dǎo)的TBSV病毒表達(dá)載體的研究.pdf

1、植物RNA病毒載體表達(dá)系統(tǒng)是一種以植物為生物反應(yīng)器的新型表達(dá)平臺(tái)。番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）在生物安全性和外源基因承載量等方面具有潛在的優(yōu)勢，是一個(gè)構(gòu)建新型植物RNA病毒表達(dá)載體的理想材料。實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了一系列TBSV病毒表達(dá)載體并能夠在寄主本氏煙上表達(dá)報(bào)道基因。在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的TBSV病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)穩(wěn)定性較差，極大地限制了該表達(dá)平臺(tái)的應(yīng)用。
　　針對(duì)上述問題，本研究在

2、前期構(gòu)建的TBSV病毒表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，優(yōu)化載體設(shè)計(jì)并利用亞克隆技術(shù)構(gòu)建了相關(guān)TBSV病毒表達(dá)載體。以農(nóng)桿菌滲濾接種法接種于植物煙草本氏煙，開展了如下相關(guān)研究。
　?、偻ㄟ^亞克隆技術(shù)對(duì)pTBSV-WY1載體的外源基因插入位點(diǎn)進(jìn)行了修改，構(gòu)建了病毒表達(dá)載體pTBSV-WY2。整株、細(xì)胞以及分子水平等三個(gè)層次的比較研究表明，pTBSV-WY2表達(dá)載體的表達(dá)效率和穩(wěn)定性都明顯優(yōu)于pTBSV-WY1。證明外源基因插入位點(diǎn)的選擇十分重要，合

3、適的外源基因插入位點(diǎn)能夠提高外源基因的表達(dá)水平和載體的表達(dá)穩(wěn)定性。
　　②選取擬南芥ACT2啟動(dòng)子(AB026654，57962-58748 bp)，通過啟動(dòng)子更換，在pTBSV-WY2的基礎(chǔ)上獲得病毒表達(dá)載體pTBSV-WY3。比較研究表明，來源不同的兩個(gè)Ⅱ型啟動(dòng)子（35S啟動(dòng)子和ACT2啟動(dòng)子）驅(qū)動(dòng)的病毒載體在外源基因的最大表達(dá)量上無顯著差異;二者在外源基因表達(dá)的時(shí)間變化規(guī)律上存在差異，推測時(shí)間變化規(guī)律上差別與啟動(dòng)子本身的性質(zhì)

4、有關(guān)。
　?、蹖?duì)在病毒基因組編碼區(qū)內(nèi)引入內(nèi)含子以提高病毒載體表達(dá)效率的可行性和規(guī)律性進(jìn)行了探索。通過亞克隆技術(shù)，在TBSV病毒基因組不同位置分別引入2個(gè)、9個(gè)和11個(gè)內(nèi)含子，構(gòu)建了TBSV病毒表達(dá)載體pTBSV-WY3-2intr，pTBSV-WY3-9intr和pTBSV-WY3-11intr。Northern blot結(jié)果表明，引入病毒基因組內(nèi)的內(nèi)含子在植物體內(nèi)能夠被識(shí)別并剪切。GFP定性和定量分析結(jié)果表明，在病毒基因組內(nèi)插入