內(nèi)含子miRNA反饋調(diào)節(jié)其宿主基因表達(dá)和功能的研究.pdf

1、microRNA是近年來非編碼RNA研究的熱點(diǎn)。miRNA是一類約22nt大小的內(nèi)源RNA，它們在組織發(fā)育和細(xì)胞分化的特定階段表達(dá)，可以在轉(zhuǎn)錄后水平對許多基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，參與發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、糖代謝、應(yīng)激和腫瘤的發(fā)生的生命活動。目前認(rèn)為，大多數(shù)miRNA首先是通過polⅡ啟動子轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生較長的，帶有帽子結(jié)構(gòu)和約80nt莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初始轉(zhuǎn)錄元(pri-miRNA)，然后通過兩種RNaseⅢ酶(Drosha和Dicer)加工

2、成為成熟的miRNA，并組裝成復(fù)合體(RISC或miRNP)。miRNA作為引導(dǎo)者，通過其5'端7～8 nt的種子區(qū)序列與靶基因的3’非翻譯區(qū)序列的完全互補(bǔ)，介導(dǎo)靶基因mRNA水平的降低或者抑制其蛋白的翻譯。隨著研究逐漸深入，各種miRNA的功能越來越被了解。根據(jù)miRNA在基因組中的定位將其分為兩類--基因間miRNA和內(nèi)含子miRNA。內(nèi)含子miRNA的研究逐漸引起人們的關(guān)注，它們來自編碼蛋白基因(宿主基因)的內(nèi)含子中，大多數(shù)的內(nèi)含

3、子miRNA與其宿主基因的表達(dá)具有一致性，這就提示它們之間在功能上有一定的關(guān)聯(lián)。文獻(xiàn)也報(bào)道有一些內(nèi)含子miRNA能夠反饋調(diào)節(jié)其宿主基因的表達(dá)和功能。本研究研究的目的就是對這種反饋調(diào)節(jié)的普遍性進(jìn)行進(jìn)一步的探究。
　　 本研究分主要為兩部分：
　　 第一部分：A549細(xì)胞中miRNA-301反饋調(diào)節(jié)其宿主基因Ska2的表達(dá)和功能
　　 肺癌是全世界癌癥死因的第一位，而且每年死亡人數(shù)都在上升，因此肺癌成為眾多腫瘤中的研

4、究熱點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)肺腺癌A549細(xì)胞中內(nèi)含子miRNA-301表達(dá)很高，用miRNA-301特異抑制劑降低內(nèi)源性miRNA-301后發(fā)現(xiàn)其宿主基因的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)A549細(xì)胞的分裂指數(shù)增加和克隆形成能力降低，這與用siRNA敲除其宿主基因Ska2產(chǎn)生的效果相同，說明miRNA-301在表達(dá)和功能上反饋調(diào)節(jié)其宿主基因。為找到miRNA-301反饋調(diào)節(jié)其宿主基因的信號通路，我們首先通過生物信息學(xué)確定miRNA-301的直接靶基因--MEOX2

5、，后續(xù)的熒光素酶試驗(yàn)和mRNA表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明MEOX2是miRNA-301的靶基因。MEOX2的功能是抑制ERK信號通路。在A549細(xì)胞中由于miRNA-301的高表達(dá)導(dǎo)致MEOX2表達(dá)下降，進(jìn)而ERK信號通路加強(qiáng)。ERK信號通路的加強(qiáng)增加其下游分子--CREB的活性。通過生物信息學(xué)和ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)CREB是Ska2的轉(zhuǎn)錄激活因子，CREB的活性增加從而導(dǎo)致上調(diào)Ska2的表達(dá)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)CREB還上調(diào)Ska2的相互作用蛋白Sk

6、a1，這就說明miRNA-301功能上反饋調(diào)節(jié)其宿主基因的功能。CREB是肺癌發(fā)生中重要因子，由于它的活性增加導(dǎo)致其下游的相關(guān)癌基因--如c-fos和egr1高表達(dá)，這可能是肺癌發(fā)生的一個(gè)重要原因。本部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面說明內(nèi)含子miRNA-301在A549細(xì)胞反饋調(diào)節(jié)其宿主基因Ska2，另一方面為肺癌的發(fā)生提供一種可能的機(jī)制。
　　 第二部分：內(nèi)含子miRNA反饋調(diào)節(jié)其宿主基因表達(dá)現(xiàn)象的普遍性研究
　　 我們第一部分的

7、研究和已發(fā)表文獻(xiàn)表明這種反饋調(diào)節(jié)可能有一定的普遍性。直接驗(yàn)證內(nèi)含子miRNA對其宿主基因功能上的反饋調(diào)節(jié)有難度，所以我們先從其對宿主基因表達(dá)上的反饋調(diào)節(jié)入手。為驗(yàn)證這種普遍性，我們我們從Sanger數(shù)據(jù)庫將所有的miRNA下載，從中找出高度保守的內(nèi)含子miRNA(大約65個(gè))，再參考ambion的miRNA在常見癌細(xì)胞中表達(dá)譜，從中再找出在我們所選的五個(gè)細(xì)胞系(HeLa、HepG2、A549、MCF-7、T24)中大部分較高表達(dá)的10個(gè)

8、miRNA，分別是miR-26a/93/107/140-5p/191/153-1/196b/208a/218-1/338-5p。根據(jù)它們的序列合成它們的抑制(二氧甲基化的反義寡核苷酸)。然后將這些抑制劑分別轉(zhuǎn)染上述五種細(xì)胞中，48小時(shí)后提總RNA，反轉(zhuǎn)錄，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測它們宿主基因的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表達(dá)大部分的miRNA會對其宿主基因的表達(dá)產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)在不同的細(xì)胞系中這種反饋調(diào)節(jié)的方向不同，譬如說miRNA-