Gytophaga hutchinsonii纖維素降解機(jī)制的研究.pdf

1、以纖維素為主要成分的植物生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源。隨著石油、煤炭等化石資源的逐漸枯竭，開發(fā)新的可再生能源已經(jīng)成為人們迫切的需求，因此對(duì)木質(zhì)纖維素的高效開發(fā)利用越來(lái)越受到人們的重視。但由于纖維素自身的特殊性質(zhì)和目前人們對(duì)已知纖維素降解微生物和降解酶認(rèn)識(shí)的不足，只有很少一部分纖維素資源被有效的利用。
　　 自然界中可降解纖維素的微生物多種多樣，其降解纖維素的策略也呈現(xiàn)多樣性。其中好氧細(xì)菌Cytophaga hutchinso

2、nii表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)晶纖維素降解能力，但其纖維素降解機(jī)制尚不明確。該菌可能利用一種既與已知的非復(fù)合體型纖維素酶酶系模式，又與復(fù)合型纖維小體模式不同的獨(dú)特纖維素降解機(jī)制以實(shí)現(xiàn)纖維素的高效降解。因此本文展開了對(duì)C.hutchinsonii降解纖維素機(jī)理的研究，主要研究了該菌對(duì)不同碳源的利用情況，并從生化和遺傳角度對(duì)其細(xì)胞膜相關(guān)主要纖維素酶進(jìn)行了研究，由此提出了該菌降解纖維素的機(jī)理模型。本文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.對(duì)C.hu

3、tchinsonii在不同碳源中的生長(zhǎng)、底物消耗與產(chǎn)物形成進(jìn)行了系統(tǒng)分析，并研究了纖維素酶在細(xì)胞中的分布。
　　 研究發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii在結(jié)晶纖維素和無(wú)定形纖維素中生長(zhǎng)時(shí)，纖維素的利用率和生物量得率都相近；首次在以纖維素為唯一碳源的C.hutchinsonii培養(yǎng)液上清中檢測(cè)到了少量葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖；同時(shí)，研究表明所獲得的C.hutchinsonii休止細(xì)胞具有酶解結(jié)晶纖維素產(chǎn)生纖維寡糖的能力，而且對(duì)纖維

4、寡糖也具有很好的水解能力。纖維二糖可以誘導(dǎo)促進(jìn)C.hutchinsonii纖維二糖和纖維寡糖的利用，使菌體生長(zhǎng)延滯期縮短。在建立了C.hutchinsoni細(xì)胞分級(jí)分離技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)纖維素酶的細(xì)胞空間分布進(jìn)行了分析，結(jié)果表明結(jié)晶纖維素能夠顯著誘導(dǎo)C.hutchinsonii細(xì)胞外膜羧甲基纖維素酶的酶活水平，而纖維二糖則能誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜中纖維二糖酶的活力水平。
　　 2.建立了熒光輔助糖電泳(FACE)技術(shù)，并成功地應(yīng)用于C.hu

5、tchinsonii纖維素降解機(jī)理的研究。
　　 發(fā)現(xiàn)FACE分離膠濃度高于32％時(shí)纖維寡糖可以有效分離；同時(shí)發(fā)現(xiàn)ANTS標(biāo)記具有較好的溫度穩(wěn)定性，并且可以對(duì)纖維素材料如Avicel，RAC和Filterpaper等進(jìn)行標(biāo)記。因此該技術(shù)可以用來(lái)分析纖維素酶對(duì)纖維素和纖維寡糖的降解產(chǎn)物，并且可以分析纖維素酶對(duì)纖維寡糖催化的糖苷鍵位置。
　　 3.建立了C.hutchinsoni膜相關(guān)蛋白提取分離技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上初步建立了

6、用于檢測(cè)C.hutchinsoni膜蛋白復(fù)合物的Blue Native-PAGE技術(shù)。
　　 在細(xì)胞分級(jí)分離的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)各種去垢劑的膜蛋白溶解效率及酶活保持能力的分析，確定了基于n-dodecyl-β-D-maltoside(DDM)的細(xì)胞膜相關(guān)蛋白提取的技術(shù)；并進(jìn)一步建立了用于檢測(cè)C.hutchinsoni膜蛋白復(fù)合物的BlueNative-PAGE技術(shù)，該技術(shù)可以保持膜蛋白復(fù)合物的活性，并且通過(guò)與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用可以鑒定復(fù)

7、合物的成分。
　　 4.首次從C.hutchinsoni細(xì)胞外膜蛋白中分離純化到了三個(gè)纖維素酶組分，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了研究。
　　 C.hutchinsonii細(xì)胞外膜蛋白分別經(jīng)過(guò)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Sephacryl S-100 HR凝膠過(guò)濾層析分離后，獲得三個(gè)純化的纖維素酶組份。經(jīng)質(zhì)譜鑒定其分別為CHU_1107，CH

8、U_1075和CHU_3384，蛋白分子量分別為136.2 kDa，274.8 kDa和33.8kDa。三種酶對(duì)羧甲基纖維素(CMC)反應(yīng)的最適pH都為5.0，最適溫度分別為45℃，40℃和45℃；底物分析結(jié)果表明，除CMC外，三種酶還可以降解地衣多糖(Lichenan)和木聚糖(Xylan)；同時(shí)三種酶對(duì)纖維寡糖都有一定降解活性。此外，CHU_1107對(duì)再生無(wú)定形纖維素(RAC)具有降解活性，而CHU_1075對(duì)幾丁質(zhì)(Chitin)

9、有一定的降解活力。去垢劑DDM和TritonX-100對(duì)CHU_1107的酶活力有明顯的促進(jìn)作用。
　　 5.在大腸桿菌中表達(dá)純化了CHU_1107和CHU_1075的催化結(jié)構(gòu)域，并對(duì)CHU_1107催化結(jié)構(gòu)域(CHU_1107 GH5)的催化特性和催化中心關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了研究。
　　 純化獲得的CHU_1107催化結(jié)構(gòu)域(CHU_1107GH5)對(duì)CMC，Lichenan，聚合度大于2的纖維寡糖(Cellodextri

10、ns DP>2)，RAC，濾紙和結(jié)晶纖維素AvicelPH-101都具有降解活性，水解產(chǎn)物以纖維二糖為主；瑞氏木霉CBH I來(lái)源的CBM結(jié)構(gòu)域?qū)HU_1107GH5降解結(jié)晶纖維素的能力具有一定促進(jìn)作用。在以Avicel PH-101進(jìn)行的水解反應(yīng)中，CHU_1107GH5可以使Avicel結(jié)晶度降低但保持平均聚合度不變，表現(xiàn)出一定的持續(xù)性催化特性。進(jìn)化分析顯示其與Saccharophagus degradans持續(xù)性催化內(nèi)切酶Cel5

11、H具有很高的同源性。通過(guò)對(duì)CHU_1107GH5催化中心保守氨基酸His131，His225和E166N的定點(diǎn)突變分析表明，所有突變體均喪失了相關(guān)水解活性，而催化中心周圍的芳香族氨基酸Trp61和Trp308可能在酶與結(jié)晶纖維素底物結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　 6.初步建立了包括轉(zhuǎn)座子隨機(jī)誘變和基因插入失活的C.hutchinsonii遺傳操作體系，并首次在C.hutchinsonii中實(shí)現(xiàn)了基因的插入失活。
　　

12、通過(guò)接合轉(zhuǎn)移，以轉(zhuǎn)座子pHimarEml對(duì)C.hutchinsonii基因組進(jìn)行隨機(jī)插入誘變，實(shí)現(xiàn)了外源DNA向C.hutchinsonii的轉(zhuǎn)移，并由此建立了一個(gè)小型轉(zhuǎn)座子突變體庫(kù)，篩選獲得了一些菌落擴(kuò)散能力增強(qiáng)的突變株。以pHimarEml為攜帶載體，實(shí)現(xiàn)了來(lái)自Flavobacterium johnsoniae的PompA啟動(dòng)子控制的綠色熒光蛋白(GFP)在C.hutchinsonii體內(nèi)的活性表達(dá)。進(jìn)一步利用自殺型質(zhì)粒pLYL03