梅林青霉對纖維素降解特性及機制的研究.pdf

1、微生物降解是目前利用纖維素最有前途和最為理想的方法，由于菌株降解纖維素活力有限；降解機制研究中菌株模式化等問題的阻礙，微生物降解利用纖維素相對有限。篩選活力較高的纖維素降解菌株并對其降解纖維素機制研究，對于解決目前面臨的環(huán)境和能源危機具有重要的理論與實踐意義。
　　本文中預試驗采集的35個降解纖維素樣本經(jīng)剛果紅纖維素粉瓊脂分離純化，得到69個纖維素降解菌株，用濾紙條培養(yǎng)基篩選得到菌株16株，再經(jīng)過以羧甲基纖維素鈉（CMC）和麥麩為

2、主的發(fā)酵培養(yǎng)基篩選，篩選得到纖維素酶活力較高的菌株5株，其中較高活性Z18菌株經(jīng)鑒定為梅林青霉（PenicilliummeliniiThom），關(guān)于其降解纖維素文獻未見報道，本文針對關(guān)于梅林青霉Z18菌株降解纖維素未知領(lǐng)域進行研究。
　　采用逐步優(yōu)化方法研究不同培養(yǎng)條件對梅林青霉生產(chǎn)纖維素酶的影響。發(fā)酵比較發(fā)現(xiàn)：碳源中麥麩誘導效果好于稻草、玉米秸、羊草；氮源發(fā)酵比較發(fā)現(xiàn)，尿素明顯降低β-葡萄糖苷酶活力。28℃和pH5.0是產(chǎn)纖維素

3、酶最佳溫度與酸堿度，當培養(yǎng)11d時各項酶活力達到最大值。溶氧量的增加提高羧甲基纖維素鈉酶和β-葡萄糖苷酶的活力，剪切力增加使濾紙酶活性降低。研究纖維素酶特性發(fā)現(xiàn)，纖維素的底物濃度影響降解效率，纖維素濃度高于5％時，產(chǎn)生明顯底物抑制。50-60℃和pH5.5是纖維素酶解的最佳溫度和酸堿度。
　　以Sigmacelltype50作為纖維素底物研究纖維素酶降解機制，發(fā)現(xiàn)外切葡聚糖酶對熱的穩(wěn)定性較低，在45℃保溫12d時，其活力下降到原活

4、力的53.71%；而在降解纖維素12d時，其活力下降到原活力的20.94%，它在纖維素降解過程中呈現(xiàn)活力快速下降的趨勢導致降低纖維素降解效率。纖維素經(jīng)酶連續(xù)與反復處理的X衍射和紅外光譜分析表明：纖維素降解初期無定形區(qū)的水解能力要大于對結(jié)晶區(qū)的水解能力，纖維素長期酶解過程中，纖維素的結(jié)晶度總體呈現(xiàn)下降趨勢，纖維素無序化造成外切葡聚糖酶吸附的困難，纖維素的超分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，存在由Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)變趨勢，而纖維素超分子結(jié)構(gòu)沒有顯示由α型向β型

5、轉(zhuǎn)變趨勢，纖維素分子內(nèi)和分子間氫鍵增加。
　　采用通常使用測定羥基自由基（HO˙）的TBA反應，經(jīng)過對多種指標的檢測，發(fā)現(xiàn)梅林青霉能夠產(chǎn)生HO˙，對超濾液處理后的纖維素采用X射線衍射測定和紅外光譜檢測，隨著處理時間的延長，纖維素的結(jié)晶度和紅外結(jié)晶系數(shù)明顯降低，同時紅外光譜檢測纖維素的葡萄糖單體上的部分羥基氧化為羧基，揭示梅林真菌降解纖維素存在氧化機制。氧化性預處理并沒有提高纖維素材料的可酶解性，紅外光譜分析顯示，F(xiàn)enton試劑預

6、處理使纖維素材料的結(jié)晶度下降，但也使纖維素材料增加過多還原性末端，說明梅林青霉降解纖維素產(chǎn)生HO˙途徑遠比Fenton反應復雜。
　　采用瑞典BioengineeringNLF19L生物反應器發(fā)酵后得到的粗酶液，經(jīng)(NH4)2SO4分級沉淀、SephadexG-100分子篩層析和DEAESephadexA-50離子交換層析等步驟，分離得到一種β-葡萄糖苷酶和兩種內(nèi)切葡聚糖酶，對純化β-葡萄糖苷酶的特性進行研究，結(jié)果表明：β-葡萄糖

7、苷酶組分的分子量分別為129kD，最適反應溫度是60℃，最適反應pH6.0，60℃以下穩(wěn)定，動力學常數(shù)Vm顯示，其具有很強催化β-葡萄糖苷鍵的水解能力，因而具有良好的研究與應用前景。
　　內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ分子量為29kD，最適和的反應溫度和最適反應pH值分別是40℃、3.5，是一種耐酸性很強、對反應的溫度要求較低的纖維素酶，由于在纖維素酶中比例較大和對濾紙有顯著的降解作用，因此推斷它是降解纖維素的主要組分。動力學常數(shù)Vm顯示，其具有

8、很高內(nèi)切葡聚糖能力，因而在紙張改性等方面具有良好的研究與應用價值。內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ分子量為38kD，最適反應溫度和pH是60℃，6.0。動力學常數(shù)Vm顯示，雖然沒有很高內(nèi)切葡聚糖能力，但該酶具有很高的木聚糖酶活性，因此在多糖化學領(lǐng)域應用有重要前景。
　　通過以上研究為梅林青霉應用奠定基礎；為纖維二糖水解酶作為今后分子定向改造的重點提供很好的啟示；揭示梅林青霉纖維素酶水解和氧化降解纖維素的部分機制；因此本文對于高效利用纖維素資源具有重