IGFBP2基因敲除導致CRF和IGF組織特異性表達.pdf

1、目的:
　　促腎上腺激素皮質釋放激素(Corticotropin releasing factor，CRF)是由下丘腦PVN區(qū)神經(jīng)元合成并分泌的一種應激神經(jīng)肽，其受體包括CRFR1和CRFR2受體。它們在下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）的功能中起重要作用。
　　類胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor，IGF）家族包括兩種

2、配體(IGF-1和IGF-2)，相應的受體（IGF-1R和IGF-2R）及六種結合蛋白(IGFBP1～6)。IGF家族在調節(jié)細胞增殖、存活、分化和遷移等方面具有重要的生物學功能。
　　我們實驗室主要研究低氧神經(jīng)內分泌網(wǎng)絡調節(jié)機制，CRF及其受體起核心作用，低氧影響肝臟和腦組織的IGF家族表達，本實驗通過整體動物和細胞學實驗，研究低氧下CRF家族和IGFBP家族可能的調節(jié)機制，以及低氧對相關細胞因子的影響;利用敲除IGFBP2小鼠比

3、較CRF家族和IGF家族的組織表達特異性;在AtT-20細胞系上研究了轉錄因子AP-1和NF-κB對CRFR1和IGF-1R受體轉錄的調節(jié)。
　　整體水平上，本實驗利用低壓低氧艙模擬7 km低氧環(huán)境，研究大鼠暴露于急性低氧（1、4、8和24 h）和拮抗劑(PDTC，NF-κB拮抗劑和CP154，526，CRFR1拮抗劑)處理后，皮層和垂體CRF，CRFR1和IGF家族基因表達變化，并利用IGFBP2敲除的小鼠和正常野生型C57小鼠

4、比較研究CRF家族和IGF家族在皮層和海馬區(qū)的基因表達變化。
　　細胞水平上，利用AtT-20細胞系，給予CRF孵育，研究轉錄因子AP-1和NF-κB對CRFR1和IGF-1R的轉錄調節(jié)。
　　方法:
　　整體實驗:
　　1.大鼠實驗:大鼠暴露于低氧艙模擬的低氧（7 km，1、4、8和24 h），動物分組為:對照組，不同時間的低氧暴露組，拮抗劑組，低氧后收集垂體，皮層和血液白細胞。
　　2.小鼠實驗:不同發(fā)

5、育年齡的C57小鼠和IGFBP2 knock-out小鼠，在出生15d和45d分別收集海馬和皮層。
　　細胞實驗:
　　利用小鼠垂體瘤細胞系（AtT-20），分為對照組，CRF處理組(10nM)，拮抗劑組(AP-1或NF-κB inhibitor)，拮抗劑+CRF組等。研究CRF通過轉錄因子AP-1和NF-κB調節(jié)CRFR1和IGF-1R轉錄。
　　研究采用實時定量PCR和Western-Blot進行檢測。
　　

6、結果:
　　1.急性低氧呈低氧時間（7km，1，4和8h）相關地增加大鼠垂體CRF mRNA的表達，24 h時降低但仍高于對照水平;急性低氧1，4，8h顯著降低大鼠垂體CRFR1 mRNA的表達，但24 h時回到對照水平。
　　2.急性低氧7km8h明顯降低了大鼠垂體和皮層IGF-1 mRNA表達;低氧4，8h增加了垂體和皮層IGF-1R mRNA的表達。
　　3.NF-κB拮抗劑和CRFR1拮抗劑部分阻斷了低氧誘導的

7、垂體CRF mRNA表達增加;也阻斷了低氧誘導的垂體CRFR1 mRNA表達的下降和垂體IGF-1R mRNA的增加。但是NF-κB拮抗劑不能阻斷低氧誘導的垂體IGF-1 mRNA表達的下降;CRFR1拮抗劑可以阻斷低氧誘導的垂體IGF-1 mRNA表達的下降。
　　4.急性低氧呈低氧時間相關地（7km，1，4和8h）增加大鼠皮層和血液白細胞TNF-α，IL-1β和IL-6 mRNA的表達。
　　5.NF-κB拮抗劑阻斷了低

8、氧誘導的血液白細胞TNF-α，IL-1β和IL-6 mRNA表達的增加;CRFR1拮抗劑阻斷了由低氧誘導的IL-1β和IL-6 mRNA表達的增加，但沒有影響TNF-αmRNA表達的增加。
　　6.在C57小鼠海馬中，隨年齡發(fā)育， IGFBP2，CRFR1和IGF-1R mRNA表達水平降低，而CRF，SPAR和NR-2B mRNA的表達無明顯變化;在IGFBP2KO的小鼠中，與正常小鼠比較， IGFBP2，CRF，CRFR1，I

9、GF-1R，SPAR和NR-2B的mRNA的表達量都顯著的下降，但不同發(fā)育階段無明顯差異;在C57小鼠皮層中，隨年齡發(fā)育，IGFBP2，CRF和NR-2B mRNA表達水平降低，而SPAR和IGF-1R mRNA表達上升，CRFR1 mRNA表達水平無明顯變化;在IGFBP2KO的小鼠中，與正常小鼠比較， IGFBP2，IGF-1R，SPAR和NR-2B的mRNA的表達量都顯著的下降，CRF的mRNA的表達量隨年齡發(fā)育下降，CRFR1

10、mRNA表達水平無明顯變化。正常小鼠海馬組織的IGFBP2蛋白隨年齡發(fā)育增加。
　　7.在AtT-20細胞系中，常氧下CRF顯著降低CRFR1mRNA表達，升高IGF-1R的mRNA表達，AP-1拮抗劑可以阻斷CRF引起的CRFR1基因表達的下降，不影響IGF-1R基因表達;NF-κB拮抗劑不能阻斷CRF引起的CRFR1基因表達的下降，也不能阻斷CRF引起的IGF-1R基因表達的上升。低氧24h，CRF進一步升高了CRFR1和IG

11、F-1R的mRNA的表達，AP-1拮抗劑不能阻斷CRF引起的CRFR1和IGF-1R的基因表達的上升;但NF-κB拮抗劑可以阻斷CRF引起的CRFR1和IGF-1R的基因表達的上升。
　　小結:
　　急性低氧垂體CRFR1和IGF-1 mRNA表達顯著下降，而CRF和IGF-1R mRNA表達顯著上升。
　　急性低氧顯著增加皮層和血液白細胞TNF-α，IL-1β和IL-6 mRNA的表達，CRFR1和NF-κB參與其基