人NR2B基因腦部特異性暫態(tài)表達(dá)大鼠模型的建立.pdf

1、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體是一種配體門控型離子通道，主要分布在突觸后膜，被認(rèn)為是神經(jīng)元突觸可塑性及長(zhǎng)時(shí)增強(qiáng)效的主要調(diào)控者。NR2B是該受體的主要調(diào)節(jié)亞單位，M2亞基上天冬氨酸殘基形成的Asn環(huán)是NMDA受體的中心部分，決定該離子通道的通透性及電導(dǎo)性。 血腦屏障是由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的緊密連接構(gòu)成的，一般物質(zhì)不容易通過(guò)。在腦部靶向性運(yùn)載中可以通過(guò)血腦屏障上高表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，所以帶有小鼠抗大鼠轉(zhuǎn)

2、鐵蛋白受體單抗(OX26)的免疫脂質(zhì)體使藥物或外源基因到達(dá)大鼠腦部是一個(gè)較好的方法。 本研究通過(guò)RT-PCR的方法成功地克隆了NR2B基因，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-NR2B(PN)，轉(zhuǎn)染CHO、未分化：PC12細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR、Western blot及間接免疫熒光(IFA)實(shí)驗(yàn)證明了構(gòu)建的重組質(zhì)?？稍诩?xì)胞中表達(dá)NR2B基因；流式細(xì)胞儀檢測(cè)到轉(zhuǎn)染的未分化PC12細(xì)胞在受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)下能發(fā)生部分凋亡，CHO細(xì)胞

3、未發(fā)生凋亡。 用PCR方法擴(kuò)增增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因EGFP，構(gòu)建得到pcDNA3.1-EGFP(PE)載體；用PCR方法克隆人突觸素蛋白SynI的啟動(dòng)子，插入到去除CMv啟動(dòng)子的PE載體，得到SynI-pcDNA3.1(-CMV)-EGFP(SPE)載體，將該載體轉(zhuǎn)染CHO，COS，PC12細(xì)胞系，通過(guò)熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)前兩種細(xì)胞中SynI啟動(dòng)子幾乎不能啟動(dòng)EGFP的表達(dá)，而在神經(jīng)樣PC12細(xì)胞中啟動(dòng)效率較

4、高，說(shuō)明其更傾向于在神經(jīng)類細(xì)胞中發(fā)揮作用。 再將NR2B基因插入到SynI-pcDNA3.1(-CMV)載體，得到SynI-pcDNA3.1(-CMV)-NR2B(SPN)重組質(zhì)粒。用逆相蒸發(fā)法將NR2B重組質(zhì)粒制備成脂質(zhì)體，將OX26巰基化后與脂質(zhì)體連接成免疫脂質(zhì)體，獲得的脂質(zhì)體包封率達(dá)30.4％，呈粒徑均勻的近球狀小囊泡、平均粒徑低于100 nm，OX26較為均勻的附著在脂質(zhì)體周圍，免疫脂質(zhì)體直接ELISA反應(yīng)呈陽(yáng)性，SD

5、S能夠釋放其包裹的DNA，說(shuō)明成功制備了免疫脂質(zhì)體。 將大鼠分成三組，第一組為正常對(duì)照組，第二、三組分別尾靜脈注射包裹PN，SPN質(zhì)粒的免疫脂質(zhì)體，48h取大腦皮層、海馬、肝、脾經(jīng)RT-PCR、定量PCR、Westem blot、免疫組織化學(xué)方法(IHC)檢測(cè)NR2B的表達(dá)，在第二組的大腦、肝、脾；第三組的大腦都能檢測(cè)到NR2B的表達(dá)，CMV啟動(dòng)子下的NR2B表達(dá)量明顯高于SynI啟動(dòng)子，但是后者能夠特異性的表達(dá)于大腦，而前者