斜紋夜蛾感染萊氏野村菌后差異表達(dá)基因的鑒定及功能研究.pdf

1、我國是世界上最大的蔬菜生產(chǎn)國家和消費(fèi)國家,保障蔬菜穩(wěn)定生產(chǎn)和供應(yīng)任務(wù)艱巨,而蔬菜病蟲害的發(fā)生是導(dǎo)致蔬菜減產(chǎn)的一個(gè)主要原因。在我國,每年因斜紋夜蛾病蟲害的發(fā)生導(dǎo)致蔬菜生產(chǎn)損失巨大。目前對斜紋夜蛾的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥,化學(xué)農(nóng)藥的長期施用不僅加深了對環(huán)境的污染,而且增加了斜紋夜蛾的抗藥性,由此導(dǎo)致對斜紋夜蛾的防治越來越困難。萊氏野村菌作為斜紋夜蛾重要的一類昆蟲病原真菌,能夠有效防治斜紋夜蛾病蟲害的發(fā)生并不會導(dǎo)致昆蟲抗藥性的產(chǎn)生。加強(qiáng)對斜紋

2、夜蛾和萊氏野村菌相互作用機(jī)制的研究有利于高效殺蟲靶標(biāo)的篩選和優(yōu)化農(nóng)藥殺蟲策略。
　　本研究以萊氏野村菌CQNr129和斜紋夜蛾為研究材料,利用消減雜交技術(shù)篩選正常和感染萊氏野村菌的斜紋夜蛾脂肪體中差異表達(dá)基因。對差異表達(dá)基因硫氧還蛋白過氧化物酶(Thioredoxinperoxidase,SlTpx)和半胱氨酸蛋白酶(Cysteineproteinases,SlCyP)進(jìn)行克隆,表達(dá),定位和功能分析,深入研究SlTpx和SlCyp

3、在防御萊氏野村菌侵染過程中的機(jī)理,為后續(xù)斜紋夜蛾免疫防衛(wèi)的分子水平研究和昆蟲與病原微生物相互作用的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為尋找更多有效的殺蟲靶標(biāo)、開發(fā)高毒殺蟲萊氏野村菌菌株和設(shè)計(jì)殺蟲策略提供理論依據(jù)。
　　本研究主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　?、傩奔y夜蛾感染萊氏野村菌后差減文庫的建立
　　1)借助差減雜交技術(shù)分離了感染萊氏野村菌的斜紋夜蛾脂肪體差異表達(dá)基因。結(jié)合斑點(diǎn)雜交我們從1175個(gè)單克隆中篩選出了345個(gè)陽性克隆,

4、經(jīng)過測序和拼接最終得到117條特異表達(dá)的基因序列。通過BLAST數(shù)據(jù)庫,GO數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻(xiàn)確定了117條Unigene潛在的生物學(xué)功能,根據(jù)他們所行使的生物學(xué)功能的不同,將它們分為7大類。在這117條序列中,有74條在非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫中找到同源序列,參與了不同的生物學(xué)過程,其余43條序列被歸類到未知功能一類。在找到的117條Unigene中只有2條在斜紋夜蛾物種中有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了研究報(bào)道,而其余115條通過BLASTn沒有找到在

5、斜紋夜蛾物種中與其相似序列,這說明這115條序列是在斜紋夜蛾中首次發(fā)現(xiàn)。
　　2)通過半定量分析,隨機(jī)篩選的7個(gè)基因在斜紋夜蛾感染萊氏野村菌后的脂肪體中有較高水平表達(dá)。通過實(shí)時(shí)熒光定量分析,Hsp70基因、Hsp90基因、gallerimycin抗真菌肽基因和半胱氨酸蛋白酶基因表達(dá)在斜紋夜蛾機(jī)體內(nèi)被萊氏野村菌侵染后都顯著上調(diào)。
　　本研究建立了斜紋夜蛾感染萊氏野村菌后脂肪體差減文庫,篩選鑒定了117條差異表達(dá)基因,其中115

6、條基因在斜紋夜蛾中首次發(fā)現(xiàn)。進(jìn)一步研究分析表明這些基因參與了斜紋夜蛾不同生物學(xué)功能并能被萊氏野村菌侵染后顯著上調(diào)表達(dá),本研究為斜紋夜蛾免疫防衛(wèi)的分子水平研究和斜紋夜蛾與萊氏野村菌相互作用的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。
　?、谛奔y夜蛾硫氧還蛋白過氧化物酶基因的功能研究
　　1)斜紋夜蛾硫氧還蛋白過氧化物酶cDNA全長1165bp序列,翻譯195個(gè)氨基酸。多序列比對顯示斜紋夜蛾同其他昆蟲的硫氧還蛋白過氧化物酶的氨基酸序列的相似性在70％以

7、上。進(jìn)化樹分析斜紋夜蛾硫氧還蛋白過氧化物酶同鱗翅目昆蟲的硫氧還蛋白過氧化物酶的親源關(guān)系較近,聚類在一起。
　　2)將硫氧還蛋白過氧化物酶在大腸桿菌中的融合表達(dá),并對融合表達(dá)蛋白酶學(xué)功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)它具有抗氧化,清除過氧化氫并保護(hù)DNA免受損傷的能力。
　　3)通過組織定位發(fā)現(xiàn),在mRNA水平上斜紋夜蛾硫氧還蛋白過氧化物酶在各個(gè)組織都能檢測到,并能被萊氏野村菌侵染后上調(diào)表達(dá),在正常斜紋夜蛾和萊氏野村菌侵染24h后的斜紋夜蛾中,

8、硫氧還蛋白過氧化物酶在血細(xì)胞中的表達(dá)量都是最高的。通過免疫印跡發(fā)現(xiàn),硫氧還蛋白過氧化物酶蛋白在正常斜紋夜蛾的血細(xì)胞和表皮系統(tǒng)中有檢測到,萊氏野村菌侵染后,在頭,血細(xì)胞,脂肪體,中腸以及馬氏管中都有檢測到,而在血清以及表皮中沒有檢測到。
　　4)斜紋夜蛾感染萊氏野村菌后,其血細(xì)胞中硫氧還蛋白過氧化物酶的mRNA和蛋白的表達(dá)趨勢跟過氧化氫處理后的表達(dá)趨勢相同。同時(shí)我們檢測了萊氏野村菌侵染后斜紋夜蛾血細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)水平,發(fā)現(xiàn)斜紋夜

9、蛾機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)水平顯著增加,進(jìn)而影響斜紋夜蛾硫氧還蛋白過氧化物酶的表達(dá)水平變化。
　　5)通過對斜紋夜蛾硫氧還蛋白過氧化物酶干擾等實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)干擾之后的斜紋夜蛾對萊氏野村菌敏感性增加并加速死亡,半致死時(shí)間顯著縮短。
　　本研究克隆了斜紋夜蛾硫氧還蛋白過氧化物酶,功能研究結(jié)果顯示斜紋夜蛾硫氧還蛋白過氧化物酶具有抗氧化,清除過氧化氫的能力。它被萊氏野村菌侵染后基因和蛋白表達(dá)顯著上調(diào),硫氧還蛋白過氧化物酶基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)通過

10、干擾下調(diào)之后,干擾組斜紋夜蛾抵抗萊氏野村菌的能力顯著下降,表明斜紋夜蛾硫氧還蛋白過氧化物酶在抵抗萊氏野村菌侵染的過程中發(fā)揮了重要作用。
　?、坌奔y夜蛾半胱氨酸蛋白酶基因的功能研究
　　1)克隆斜紋夜蛾半胱氨酸蛋白酶cDNA全長序列,全長序列翻譯344個(gè)氨基酸。多序列比對顯示斜紋夜蛾半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列同其他昆蟲的半胱氨酸蛋白酶蛋白序列的相似性在75%以上。進(jìn)化樹分析斜紋夜蛾半胱氨酸蛋白酶同鱗翅目昆蟲的半胱氨酸蛋白酶的親源

11、關(guān)系較近,聚類在一起。
　　2)通過實(shí)時(shí)熒光定量和Westernblotting結(jié)果發(fā)現(xiàn),斜紋夜蛾各組織中半胱氨酸蛋白酶無論是在mRNA水平還是在蛋白水平都能在被萊氏野村菌侵染后上調(diào)表達(dá)。在正常和被萊氏野村菌侵染24h后的斜紋夜蛾中,半胱氨酸蛋白酶在血細(xì)胞中的表達(dá)量都是最高的,其次是脂肪體中。
　　3)斜紋夜蛾感染萊氏野村菌后,半胱氨酸蛋白酶的mRNA及蛋白在斜紋夜蛾血細(xì)胞以及脂肪體中的表達(dá)都顯著上調(diào)。同時(shí)我們檢測了萊氏野村

12、菌侵染后斜紋夜蛾血淋巴中半胱氨酸蛋白酶水解活性,發(fā)現(xiàn)侵染后的斜紋夜蛾血淋巴中半胱氨酸蛋白酶酶活水平要比正常和PBS處理的斜紋夜蛾中半胱氨酸蛋白酶的酶活要高。
　　4)檢測了斜紋夜蛾半胱氨酸蛋白酶在各個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)以及酶活變化,結(jié)果顯示斜紋夜蛾半胱氨酸蛋白酶的mRNA以及蛋白在六齡脫皮及變態(tài)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)顯著上調(diào)。同時(shí)斜紋夜蛾半胱氨酸蛋白酶酶活也在這兩個(gè)發(fā)育時(shí)期顯著增加。
　　5)斜紋夜蛾半胱氨酸蛋白酶干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾

13、處理后的斜紋夜蛾幼蟲,蛹以及成蟲表型產(chǎn)生變化,并且斜紋夜蛾對萊氏野村菌的侵染敏感性顯著增加并導(dǎo)致其死亡加速,半致死時(shí)間顯著縮短。
　　本研究克隆了斜紋夜蛾半胱氨酸蛋白酶,研究表明斜紋夜蛾半胱氨酸蛋白酶在昆蟲發(fā)育過程中參了重要的功能,尤其是在變態(tài)發(fā)育期間。研究顯示半胱氨酸蛋白酶不僅能被萊氏野村菌侵染后表達(dá)顯著上調(diào),并且其轉(zhuǎn)錄水平通過干擾下調(diào)之后,干擾組斜紋夜蛾抵抗萊氏野村菌的能力顯著下降,說明在抵抗萊氏野村菌侵染的過程中發(fā)揮了重要作