不同環(huán)境中木聚糖酶基因多樣性分析及宏基因組來源的新基因克隆與表達(dá).pdf

1、木聚糖是植物細(xì)胞壁的主要組成成分,也是自然界中除纖維素之外第二豐富的再生資源。木聚糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其完全降解需要多種酶的共同作用。木聚糖酶能夠有效地降解木聚糖主鏈的β-1,4-糖苷鍵,是木聚糖降解中的關(guān)鍵酶。木聚糖酶廣泛分布在微生物中,后者通過對(duì)木聚糖的降解利用而在自然界中的碳循環(huán)中起到很重要的作用。木聚糖酶在飼料、食品、造紙和生物能源等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域中也有著重要的應(yīng)用價(jià)值而被廣泛研究?，F(xiàn)在獲得的絕大部分的木聚糖酶都是來自分離純化的微生物,

2、而越來越多的實(shí)驗(yàn)表明環(huán)境微生物中絕大多數(shù)是未培養(yǎng)的。怎樣發(fā)掘未培養(yǎng)微生物的基因資源,找到具有應(yīng)用價(jià)值的木聚糖酶成為新的研究熱點(diǎn)。
　　 木聚糖酶主要?jiǎng)澐衷谔擒账饷傅牡?0和11家族。本研究通過對(duì)這兩個(gè)家族的木聚糖酶蛋白序列的比對(duì),確定了四個(gè)靠近活性中心或底物結(jié)合位點(diǎn)的保守區(qū)?；谝恢?簡(jiǎn)并雜交寡核苷酸引物(CODEHOP)的3’簡(jiǎn)并5’保守的原理,設(shè)計(jì)了兩套簡(jiǎn)并引物,X10-F／X10-R和X11-F／X11-R。該引物可從具

3、有木聚糖降解能力的細(xì)菌和真菌代表菌株中高效擴(kuò)增到目的基因片段,因此用于環(huán)境中木聚糖酶基因多樣性的研究。
　　 以雪蓮根際土壤、冰川土壤、溫泉高溫土壤、菜園土、池塘底泥、和紅樹林土壤的宏基因組DNA為模板,以X10-F／X10-R或X11-F／X11—R為引物,分別從6個(gè)不同性質(zhì)的土壤環(huán)境中擴(kuò)增木聚糖酶基因片段。除溫泉高溫土壤中只能擴(kuò)增到第10家族的木聚糖酶基因片段外,從其他土壤環(huán)境中都能擴(kuò)增得到相應(yīng)大小的兩個(gè)家族木聚糖酶的基因片

4、段(第10家族大約260 bp,第11家族210 bp左右)。將PCR產(chǎn)物純化后連接載體轉(zhuǎn)化構(gòu)建了11個(gè)片段文庫。從各個(gè)文庫中隨機(jī)挑選了共2115個(gè)陽性克隆,經(jīng)測(cè)序及序列分析表明1075個(gè)序列是第10家族的木聚糖酶基因片段,684個(gè)序列是第11家族的木聚糖酶基因片段。經(jīng)去冗余分析后,得到了490個(gè)相似性低于95％的特異基因片段,其中368個(gè)為第10家族的序列,122個(gè)第11家族的序列。序列比對(duì)分析表明75％的基因片段與已知序列相似性在8

5、0％以下,54％的序列與已知基因的相似性低于65％。該結(jié)果說明土壤環(huán)境中存在大量的木聚糖酶基因,且大部分具有很高的序列新穎性。通過進(jìn)化,多樣性和豐度的分析發(fā)現(xiàn),6個(gè)環(huán)境中的木聚糖酶基因的分布和多樣性都有很大的差別,而且各個(gè)環(huán)境中豐度較高的基因也不一樣,說明不同環(huán)境中降解木聚糖的優(yōu)勢(shì)菌群存在顯著差異。表明土壤環(huán)境中的木聚糖酶基因的分布和環(huán)境有很大的關(guān)系,而土壤環(huán)境因子(pH、含氧量、溫度、有機(jī)質(zhì)的含量等)可能是造成木聚糖酶基因的分布和多樣

6、性差異的主要原因。土壤環(huán)境來源的第10家族木聚糖酶絕大多數(shù)來源于細(xì)菌,而第11家族木聚糖酶序列中真菌來源的比細(xì)菌來源的要多。此外,土壤環(huán)境中第11家族的木聚糖酶的基因的多樣性要遠(yuǎn)低于第10家族的。這種分布和多樣性的不同暗示這兩個(gè)糖苷水解酶家族在木聚糖的降解過程中可能發(fā)揮著不同的作用。
　　 瘤胃內(nèi)存在大量的微生物,是一個(gè)植物細(xì)胞壁多糖高效降解的環(huán)境。通過使用上述方法,從山羊瘤胃和綿羊瘤胃中一共獲得了173個(gè)特異的木聚糖酶基因片段

7、,其中107個(gè)片段為第10家族的木聚糖酶基因片段,其他屬于第11家族。序列比對(duì)分析表明這些片段與已知木聚糖酶的相似性整體上要比土壤環(huán)境來源的相似性要低,說明瘤胃環(huán)境中存在大量的更為新穎的木聚糖酶。進(jìn)一步的基因多樣性,豐度和進(jìn)化分析指出兩大家族的木聚糖酶基因來源于不同的微生物,第10家族的木聚糖酶基因主要集中在非纖維素降解微生物,而第11家族的基因主要來源于纖維素降解微生物。該結(jié)果表明兩個(gè)家族的木聚糖酶在瘤胃環(huán)境內(nèi)木質(zhì)纖維素降解過程中發(fā)揮

8、的作用是不一樣的。此外,不同瘤胃來源的木聚糖酶基因比較分析發(fā)現(xiàn)瘤胃中木聚糖降解微生物的分布是類似的,但也存在一定的差異。每個(gè)瘤胃環(huán)境中發(fā)揮主要木聚糖降解作用的菌物不同,且都存在特有的木聚糖降解微生物。而這種差異可能與宿主對(duì)微生物的選擇有一定的關(guān)系。
　　 基于10個(gè)山羊瘤胃環(huán)境來源的木聚糖酶基因片段序列,采用改進(jìn)的TAIL-PCR方法,以山羊瘤胃宏基因組DNA為模板,最終獲得了7個(gè)全長(zhǎng)基因。其中,xynGR40,xynGR67,

9、xynGR77,xynGR112和xynGR117編碼的木聚糖酶屬于第10家族,xynR8和xynR127編碼第11家族的木聚糖酶。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)這些基因與已知基因的相似性為45-75％,表明這些基因都具有很高的新穎性。除XynR8無信號(hào)肽外,其它的蛋白都含有信號(hào)肽,可以分泌表達(dá)。通過結(jié)構(gòu)域分析,發(fā)現(xiàn)XynGR40,XynGR77,XynGR117和XynR127是多結(jié)構(gòu)域蛋白,而且其中的XynGR77和XynR127具有特殊的結(jié)構(gòu),

10、這為以后的木聚糖酶的結(jié)構(gòu)與功能研究提供了很好的實(shí)驗(yàn)材料。
　　 其中的四個(gè)木聚糖酶基因xynGR40,xynGR67,xynR8和xynR127經(jīng)原核表達(dá)后,重組酶進(jìn)行了純化和酶學(xué)性質(zhì)分析。這四個(gè)酶的比活相對(duì)于大多數(shù)的木聚糖酶都高,這與瘤胃來源的酶具有相對(duì)較高的催化活性是一致的。它們的最適pH在5.5到6.5之間,與瘤胃液的pH(5.8)接近。最適溫度差異很大,低至30℃(XynGR40),高至55℃(XynR8)。XynGR4

11、0有低溫活性,在0℃還剩余10％的酶活。氨基酸的組成、鹽橋和氫鍵的分析以及與嗜熱酶在三維結(jié)構(gòu)上的比較說明XynGR40是一個(gè)低溫木聚糖酶。XynGR40是第一個(gè)從瘤胃環(huán)境中報(bào)道的低溫木聚糖酶,它的特殊性質(zhì)和結(jié)構(gòu)為研究木聚糖酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了很好的材料。同時(shí),XynGR40在中溫下的熱穩(wěn)定性、高比活、較好的抗離子能力以及產(chǎn)物簡(jiǎn)單等特性表明XynGR40在工業(yè)上有良好的應(yīng)用前景。
　　 總而言之,本研究建立了一個(gè)快速、有效的