抗原處理與提呈相關(guān)基因在重癥肌無力患者胸腺組織表達的研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　抗原處理與提呈在特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，抗原處理與提呈不僅能啟動特異性T細胞應(yīng)答和B細胞應(yīng)答，也是決定特異性免疫應(yīng)答類型的重要因素。發(fā)揮抗原處理與提呈功能的細胞被稱為抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APCs），其中樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、單核吞噬細胞和B細胞為專職 APCs（professional APCs），上皮細胞、內(nèi)皮細胞和靶細胞等被

2、稱為非專職APC（non-professional APCs）?？乖幚砼c提呈也在胸腺組織中發(fā)生。胸腺組織中存在胸腺上皮細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等胸腺基質(zhì)細胞，它們構(gòu)成T細胞在胸腺成熟的微環(huán)境，這些細胞表面表達MHC-I類分子和MHC-II類分子，也存在與抗原攝取和提呈相關(guān)的模式識別受體（ pattern recognition receptor， PRR）、補體受體（ complement receptor， CR）、協(xié)同刺激分子（

3、co-stimulating molecular）等，這些細胞也能分泌多種細胞因子。這些細胞正是通過其膜表面分子、及其釋放的細胞因子等因素影響 T細胞在胸腺的分化成熟過程，影響不同T細胞亞群的成熟。重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是T細胞依賴性自身免疫性疾病，多數(shù)（80％以上）患者存在胸腺增生、胸腺瘤等異常表現(xiàn)。T細胞在胸腺分化成熟過程中，需要與胸腺皮質(zhì)上皮細胞、胸腺髓質(zhì)上皮細胞和胸腺樹突狀細胞相互作用，經(jīng)歷陽性選

4、擇、陰性選擇后獲得MHC限制性和自身耐受性，才能分化為成熟的功能性 T細胞，到達外周發(fā)揮重要的免疫學(xué)作用。陽性選擇和陰性選擇的重要機制就是胸腺上皮細胞和胸腺樹突狀細胞的抗原提呈作用。因此探討重癥肌無力患者胸腺組織中樹突狀細胞及與抗原提呈相關(guān)基因的表達有助于揭示MG患者T細胞異常分化的機制，為臨床疾病的診治打下基礎(chǔ)。
　　1、材料與方法:
　　1.1、胸腺組織RNA抽提
　　取50mg去筋膜、血污后的胸腺組織，加入ImL

5、 TRIZOL試劑，用勻漿器反復(fù)研磨制成勻漿。將勻漿置室溫（15到30℃）孵育5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合體完全解離。每1ml的TRIZOL試劑勻漿中加入0.2ml的氯仿，劇烈振蕩15s再置室溫孵育3min。4℃12,000g離心15min。小心吸取水相，并將其轉(zhuǎn)移至新管中。向水相中以1ml TRIZOL試劑加0.5ml的比例加入異丙醇，混勻，室溫孵育10min，4℃12,000 g離心10min。去上清，加入1ml75%乙醇，清洗RNA沉淀

6、。去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5-10min。加入不含RNA酶的水，反復(fù)吹打，60℃孵育10min使RNA溶解。-70℃保存。
　　1.2、 RNA純化及質(zhì)量檢測
　　按照產(chǎn)品說明書將RNA溶液過柱（RNeasy MinElute Spin Column）、洗脫，獲得純化RNA。紫外吸收測定法檢測RNA純度：用A260/A280的比值檢測RNA純度。變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度：制作1%變性瓊脂糖凝膠，取0.5μg

7、 RNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育5分鐘使樣品變性。上樣后，5–6V/cm電壓下電泳。紫外透射光下觀察、拍照。
　　1.3、 cDNA合成
　　取1.5μg RNA，加入500ng/μl oligo（dT）1μL，10mM dNTPs Mix1μL，最后加滅菌水至13μL?；靹蚝?，置65℃5min冰上1min，短促離心后向離心管中依次加入5× First-St

8、rand Buffer4μl、0.1M DTT1μl、RNase Inhibitor1μl、SuperScript III RT1μl?；靹颍?0℃溫育60min，70℃15min使酶失活。每20μl cDNA加91μl滅菌水混勻，-20℃保存。
　　1.4、實時定量PCR
　　取已稀釋的cDNA102μL，加入2× SuperArray PCR master mix550μL，ddH2O448μL。打開PCR Array上

9、的膜、加10ul混合液到PCR Array對應(yīng)的每個孔中，小心蓋上蓋子密封PCR Array，在設(shè)置PCR程序前將準備好的PCR Array放在冰上，實時定量PCR程序設(shè)置完后，將PCR Array置于實時定量PCR儀進行PCR反應(yīng)。步驟如下：聚合酶激活、變性95℃，10min；95℃15s、60℃1min，擴增40個循環(huán)。收集熒光，進行溶解曲線分析。
　　1.5、數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計學(xué)分析
　　采用ΔΔCt方法。計算每一實驗組和

10、對照組中每個基因的ΔCt，ΔCt(group1)=average Ct–average of HK genes’ Ct for group1 array，ΔCt(group2)=average Ct–average of HK genes’ Ct for group2 array。計算2個PCR Array（或兩組）中每個基因的ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt(組2)-ΔCt(組1)，通常組1是對照，組2是實驗組。同過2-ΔΔCt計算組2與組

11、1對應(yīng)基因的表達差異。當(dāng)實驗組與對照組2-ΔΔCt之比大于2或小于0.5，為顯著增高或降低。統(tǒng)計學(xué)分析（p值）采用Student’s t檢驗，計算對照組和實驗組每個基因的2^(-Delta Ct)值, p<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2、結(jié)果：
　　2.1、樹突狀細胞和抗原提呈細胞PCR芯片的基因分類
　　該基因芯片中含有84種基因，根據(jù)這些基因的功能不同將其分為8類基因，即：抗原攝取相關(guān)基因、抗原提呈相關(guān)基因、DC

12、s趨化作用相關(guān)基因、DCs分化相關(guān)基因、細胞因子、細胞因子受體相關(guān)基因、其它細胞表面受體基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。
　　2.2、 MG患者與對照組胸腺組織基因表達的差異
　　經(jīng)熒光定量PCR檢測和統(tǒng)計學(xué)分析，從84種檢測的基因中發(fā)現(xiàn)9種基因表達在MG患者胸腺組織顯著高于對照組。從MG患者胸腺組織異常表達基因的功能分析，這些基因主要集中在2個方面： TAP2、CD4和THBS1是與抗原攝取、抗原提呈相關(guān)的基因；CCL2、CCL3、C