趨化因子及其受體在重癥肌無(wú)力患者胸腺組織的異常表達(dá)和作用.pdf

1、目的:
　　 胸腺是中樞免疫器官，是T淋巴細(xì)胞發(fā)育分化成熟的重要器官。正常的胸腺功能對(duì)人體免疫功能的維持十分重要。如果人體的免疫平衡被打破，就可能引發(fā)各種免疫性疾病。淋巴細(xì)胞執(zhí)行人體的免疫功能，對(duì)人體的免疫狀況起著非常重要的作用.主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞等。近年來(lái)，對(duì)淋巴細(xì)胞的分化和功能、以及與疾病發(fā)生關(guān)系的研究報(bào)道很多，在某些方面也有顯著進(jìn)展。其中趨化性細(xì)胞因子在淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化、成熟、及其功能上的作用，

2、越來(lái)越受到關(guān)注。淋巴細(xì)胞的發(fā)育受多種細(xì)胞表面分子和細(xì)胞因子的調(diào)控，趨化因子(chemokines)是一類對(duì)細(xì)胞具有趨化作用的細(xì)胞因子，能直接引導(dǎo)白細(xì)胞定向遷移，并具有活化和遷移細(xì)胞的功能。淋巴干/祖細(xì)胞由骨髓經(jīng)血液向胸腺的遷移和定植、成熟淋巴細(xì)胞歸巢和動(dòng)態(tài)分布、各種免疫細(xì)胞的分化、活化等均受到趨化因子的影響和調(diào)節(jié)。
　　 重癥肌無(wú)力是由抗體介導(dǎo)的，與T淋巴細(xì)胞和免疫功能異常相關(guān)的自身免疫性疾病。已有研究報(bào)道，多數(shù)MG患者胸腺細(xì)胞

3、異常增生，胸腺細(xì)胞亞群比例異常。胸腺組織中出現(xiàn)淋巴結(jié)樣的T細(xì)胞區(qū)和富含B細(xì)胞的生發(fā)中心是MG患者胸腺異常增生的典型病理改變，且從MG增生型胸腺組織分離純化的B細(xì)胞能產(chǎn)生抗乙酰膽堿受體(AchR)抗體，胸腺切除后抗AchR抗體滴度降低，患者癥狀好轉(zhuǎn)。為探討MG患者胸腺中胸腺細(xì)胞亞群異常及B細(xì)胞生發(fā)中心形成的原因，本文通過(guò)基因芯片、熒光定量PCR、趨化實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化等方法對(duì)MG患者胸腺組織趨化因子及其受體的異常表達(dá)和作用進(jìn)行了分

4、析。旨在比較MG患者和正常對(duì)照組胸腺組織中趨化因子及其受體的表達(dá)情況，探討趨化因子及其受體在MG患者胸腺組織的異常表達(dá)和作用。
　　 方法:
　　 1.研究對(duì)象：MG患者12例，胸腺組織病理類型為增生型；先天性心臟病患者10例，胸腺組織病理檢查未見(jiàn)異常，做為對(duì)照。
　　 2.胸腺組織趨化因子及其受體mRNA的基因芯片分析：無(wú)菌取MG患者和先心病患者手術(shù)切除的胸腺組織，提取總RNA，而后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行

5、體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記的cDNA，并與基因芯片進(jìn)行雜交，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)MG患者和正常胸腺組織的基因表達(dá)情況，篩選出差異性表達(dá)的趨化因子及其受體。
　　 3.熒光定量PCR驗(yàn)證趨化因子及其受體的表達(dá)：提取胸腺組織總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，從芯片結(jié)果差異性表達(dá)的趨化因子及受體中選取幾種，采用熒光定量PCR對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 4.MG患者胸腺組織趨化因子CCL25的分布情況：制作胸腺組織石蠟切片，采用免疫組

6、化方法檢測(cè)趨化因子CCL25在MG和正常胸腺組織表達(dá)的差異。
　　 5.胸腺組織提取液對(duì)胸腺細(xì)胞的趨化作用：從胸腺組織中無(wú)菌分離制備胸腺細(xì)胞懸液和胸腺組織提取液，采用趨化實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)觀察MG患者胸腺組織提取液對(duì)MG胸腺細(xì)胞的趨化作用，與正常胸腺組織提取液對(duì)正常胸腺細(xì)胞的趨化作用對(duì)比，對(duì)兩者的趨化指數(shù)進(jìn)行比較分析。
　　 6.MG患者外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)趨化因子受體CCR9水平：無(wú)菌制備外周血淋巴細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)

7、觀察病例組和對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群和趨化因子受體CCR9的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、MG患者胸腺趨化因子及其受體mRNA的表達(dá)：基因芯片結(jié)果顯示，在檢測(cè)的70種趨化因子及其受體中，有49種基因在MG患者和對(duì)照組胸腺組織表達(dá)量均低，有21種基因在MG和對(duì)照組胸腺呈顯著表達(dá)。通過(guò)對(duì)顯著表達(dá)基因的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)CCL3、CCL22、CCL25、CCR7、CCR9、CXCL12基因在MG患者胸腺表達(dá)顯著高于對(duì)照組，CCL2

8、、CX3CL1、CXCL10、CXCR6、IL-8基因在MG患者胸腺組織表達(dá)顯著低于對(duì)照組。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果與基因芯片基本相符。
　　 2、胸腺組織CCL25的表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示，與正常胸腺組織相比，趨化因子CCL25在MG胸腺組織呈現(xiàn)高表達(dá)，且主要表達(dá)于皮髓交界處胸腺基質(zhì)胞。
　　 3、胸腺組織提取液對(duì)胸腺細(xì)胞的趨化作用：MG胸腺提取液對(duì)CD8+單陽(yáng)性細(xì)胞有較強(qiáng)的趨化作用；用SPSS17.

9、0對(duì)MG組和正常對(duì)照組趨化指數(shù)進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，MG組的趨化指數(shù)顯著高于對(duì)照組，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、外周血淋巴細(xì)胞CCR9表達(dá)：流式結(jié)果分析顯示，外周血淋巴細(xì)胞上CD4+CCR9-細(xì)胞在MG組顯著高于正常對(duì)照組，CD8+CCR9+、CD19+CCR9+細(xì)胞在MG組均顯著低于正常對(duì)照組。
　　 結(jié)論:
　　 MG患者胸腺組織中存在趨化因子及其受體的表達(dá)異常，CCL25及