稀有鮈鯽銅藍(lán)蛋白基因克隆及五氯酚對(duì)其DNA甲基化影響.pdf

1、銅藍(lán)蛋白（Ceruloplasmin，EC1.16.3，縮寫為Cp）是一種重要的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與生物體內(nèi)銅的轉(zhuǎn)運(yùn)、鐵的代謝、氧化自由基的清除、新生毛細(xì)血管的形成、神經(jīng)及胚胎發(fā)育等過程。銅藍(lán)蛋白在生物體發(fā)育的不同階段，為各種組織器官提供高效、穩(wěn)定、易于利用的銅源，滿足生命活動(dòng)所需。同時(shí)，在醫(yī)學(xué)上是各種炎癥、感染、中毒及癌癥疾病的標(biāo)志性蛋白。銅藍(lán)蛋白自發(fā)現(xiàn)以來備受研究人員的關(guān)注，在人和小鼠中該蛋白的研究已取得豐碩成果，但在魚類中報(bào)道較少，尤

2、其在稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）中還是空白。此外，隨著環(huán)境污染不斷加重，人們開始重視環(huán)境檢測(cè)、污染治理及污染對(duì)人類影響等方面的研究。水污染作為環(huán)境污染重要組成部分，與人類日常生活密切相關(guān)，成為治理與監(jiān)測(cè)中的重點(diǎn)。據(jù)調(diào)查研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國(guó)各大水系中五氯酚的檢出率和平均濃度相對(duì)較高，成為水環(huán)境中較大的污染源，已被列為優(yōu)先監(jiān)測(cè)及嚴(yán)格控制的持久性環(huán)境污染物，對(duì)其的監(jiān)測(cè)和影響研究成為眾多研究領(lǐng)域中的重要目標(biāo)。而近年來，表觀遺傳學(xué)

3、作為分子毒理學(xué)研究的最新熱點(diǎn)，成為了低劑量環(huán)境污染對(duì)生物體損害影響研究中的重要組成部分。
　　因此，本論文的研究?jī)?nèi)容主要分為兩個(gè)部分:第一部分，通過RACE和基因組步移技術(shù)，對(duì)稀有鮈鯽銅藍(lán)蛋白基因全長(zhǎng)cDNA和啟動(dòng)子序列進(jìn)行克隆及序列生物信息學(xué)分析、蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和組織表達(dá)分布研究;第二部分，根據(jù)我國(guó)水系中五氯酚的實(shí)際污染情況，在實(shí)驗(yàn)室中復(fù)制了五氯酚對(duì)魚類影響的亞慢性毒性試驗(yàn)，通過分析稀有鮈鯽肝臟銅藍(lán)蛋白基因的D

4、NA甲基化差異，來研究稀有鮈鯽體內(nèi)該基因在五氯酚暴露下的調(diào)節(jié)反應(yīng)。本論文的主要研究結(jié)論如下:
　　1.基于序列同源性，采用RACE技術(shù)，以稀有鮈鯽肝臟cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為3389 bp的銅藍(lán)蛋白基因全長(zhǎng)cDNA序列，其中包含22 bp的5'UTR序列和103 bp的3'UTR序列，3264 bp的開放式閱讀框，預(yù)測(cè)編碼1087個(gè)氨基酸。同源性分析結(jié)果顯示，稀有鮈鯽銅藍(lán)蛋白與斑馬魚銅藍(lán)蛋白的核苷酸、氨基酸序列同源

5、性最高，分別為88.1％和90.3％。
　　2.基于獲得的cDNA5'UTR序列，采用基因組步移技術(shù)，得到啟動(dòng)子序列共1430 bp，核心區(qū)域730 bp，GC含量為40.55％，有1個(gè)滿評(píng)分的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，同時(shí)存在GATA-1，2，3和CdxA等數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　3.稀有鮈鯽銅藍(lán)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為124429.1D，等電點(diǎn)為6.41，含有A1、A2和B等9個(gè)結(jié)構(gòu)域。高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，稀有鮈鯽銅藍(lán)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主

6、要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)卷曲組成。分別占29.53％、7.64％、23.09％和39.74％。三級(jí)結(jié)構(gòu)3D模型圖顯示，稀有鮈鯽銅藍(lán)蛋白與斑馬魚、人銅藍(lán)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，屬同一蛋白模型。
　　4.運(yùn)用MEGA5軟件比對(duì)氨基酸序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。13個(gè)物種分為4組:哺乳類、鳥類和爬行類屬于一組，兩棲類獨(dú)自為一組，稀有鮈鯽、斑馬魚和斑點(diǎn)叉尾鮰聚為一支，其他4種魚類構(gòu)成一組，其中稀有鮈鯽與斑馬魚親緣關(guān)系最近。
　　5.

7、采用熒光定量PCR法，以β-actin為內(nèi)參基因，分析銅藍(lán)蛋白在稀有鮈鯽不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示該基因廣泛分布于各組織中，其中肝臟的相對(duì)表達(dá)量最高且顯著高于其他組織(P＜0.01)，其他組織表達(dá)量較低且組織間差異均不顯著(P＞0.05)。
　　6.五氯酚暴露處理60天后，提取稀有鮈鯽肝臟DNA，進(jìn)行銅藍(lán)蛋白基因DNA甲基化水平分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)組別中該基因DNA甲基化程度分別為63.16％（對(duì)照組）、67.54％(0.6