廣譜病毒感染抑制劑的篩選及其作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、近年來，諸如SARS、MERS、禽流感和埃博拉等新發(fā)突發(fā)傳染病疫情的暴發(fā)日趨頻繁，因此，依據(jù)病毒的基本生物學(xué)特性，針對病毒侵染宿主細(xì)胞的共性靶點，研發(fā)新型廣譜性長效病毒感染抑制劑，對于應(yīng)對病毒性傳染病疫情的持續(xù)挑戰(zhàn)具有重要意義。
　　植物化合物被稱為“第七類營養(yǎng)素”，廣泛存在于日常食物，是一類對人體健康具有特殊作用的非營養(yǎng)性化學(xué)物質(zhì)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)部分植物化合物具有抑制病毒感染的生物活性，并逐漸成為抗病毒研究的熱點之一，如表沒食子兒

2、茶素沒食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate，EGCG），單寧酸(Tannins)，黃芪多糖(AstragalusPolysacharin，APS)等。初步的研究結(jié)果顯示:植物化合物的生物學(xué)效應(yīng)主要表現(xiàn)在其對細(xì)胞膜生物學(xué)特性的影響和局部微環(huán)境平衡的改變等方面，部分植物化合物通過直接嵌入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜正常的功能性流動，進(jìn)而發(fā)揮一定的生物學(xué)效應(yīng)。病毒是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生生物，只有順利穿過宿主細(xì)胞膜

3、并成功進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒，才能完成其感染增殖周期，因此，細(xì)胞膜是絕大多數(shù)病毒必須突破的第一道宿主防御屏障，是其啟動成功感染的“必經(jīng)之路”，也是各種病毒必須克服的共性障礙。從宿主細(xì)胞的角度來講，病毒對細(xì)胞膜的侵入是一個病理性的過程，必然會導(dǎo)致宿主細(xì)胞膜生理特性的一些變化，如細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的流動性或細(xì)胞膜電勢電位的改變。針對此類植物化合物抑制病毒感染機(jī)制的研究，多數(shù)集中于干擾某一種病毒的特異性感染靶點的描述，而有關(guān)其廣譜性抑制病毒感染機(jī)理

4、的探索相對較少，尤其是關(guān)于在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，植物化合物對細(xì)胞膜的生物學(xué)效應(yīng)是否能夠拮抗或干擾病毒對宿主細(xì)胞膜的病理性影響，進(jìn)而導(dǎo)致病毒的胞膜侵染和胞飲內(nèi)吞功能障礙等方面的研究，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。
　　本研究分別以流感病毒和腺病毒的細(xì)胞感染模型為基礎(chǔ)，通過對表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，單寧酸(Tannins)，黃芪多糖(APS)等三種植物化合物抑制病毒感染效果的初步評價，分析此三種植物化合物在不同條件下抑制病

5、毒感染的特點和效力，分別利用熒光偏振技術(shù)和熒光標(biāo)記膜電位檢測技術(shù)，比較不同條件下，植物化合物和病毒對細(xì)胞膜流動性和膜電位的影響以及相關(guān)的變化規(guī)律，期望對植物化合物廣譜性抑制病毒感染的機(jī)制開展一些初步的探索，并為研制廣譜性的病毒感染抑制劑提供技術(shù)支持，切實提高整體應(yīng)對病毒性傳染病的預(yù)防能力和控制水平。
　　一、EGCG、單寧酸和黃芪多糖體外抑制病毒感染效果的分析
　　利用5型腺病毒細(xì)胞感染模型和甲型H1N1流感病毒細(xì)胞感染模型

6、，通過中性紅吞噬技術(shù)，分別開展EGCG、單寧酸和黃芪多糖等三種植物化合物對293A細(xì)胞和MDCK細(xì)胞的毒性分析研究，結(jié)果顯示:1、EGCG、單寧酸和黃芪多糖對293A細(xì)胞的最大無毒性濃度(TC0)分別為640μg/ml、1280μg/ml和1280μg/ml，對照樣品利巴韋林的TC0為640μg/ml。2、EGCG、單寧酸和黃芪多糖對MDCK細(xì)胞的最大無毒性濃度(TC0)分別為1280μg/ml、640μg/ml和1280μg/ml，對

7、照樣品利巴韋林的TC0為640μg/ml。顯然，所篩選的三種植物化合物的細(xì)胞毒性均不高于已經(jīng)獲得安全許可的對照樣品利巴韋林。
　　為進(jìn)一步明確此三種植物化合物體外抑制病毒感染的效果，分別利用感染劑量均為100TCID50的5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒，依次在病毒感染前、感染同時和感染后三種條件下，分別添加三種植物化合物，通過觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)，分析此三種植物化合物抑制CPE的有效濃度，結(jié)

8、果顯示:1、感染腺病毒時，EGCG在上述三種條件下的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為162±11μg/ml、607±29μg/ml和325±26μg/ml;單寧酸的IC50分別為303±47μg/ml、197±19μg/ml和400±40μg/ml;而黃芪多糖僅在病毒吸附前加入時具有一定的抑制作用，IC50為449±50μg/ml;對照樣品利巴韋林的IC50分別為604±25μg/ml、561±52μg/ml和177±27μg/ml。2、

9、感染甲型H1N1病毒時，EGCG在上述三種條件下的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為465±15μg/ml、543±37μg/ml和519±55μg/ml;在病毒吸附前和吸附同時添加單寧酸時，均可檢測到明顯的抑制作用，IC50分別為411±54μg/ml和234±361μg/ml;但沒有檢測到黃芪多糖抑制CPE效果，而對照樣品利巴韋林僅在病毒吸附后添加時，具有抑制細(xì)胞病變的效果，IC50為330±24μg/ml。
　　很顯然，在細(xì)胞水

10、平的安全使用濃度下，病毒感染前，首先添加EGCG溫育60分鐘預(yù)處理細(xì)胞，與病毒吸附的同時添加單寧酸溫育60分鐘，EGCG和單寧酸均具有顯著的抑制細(xì)胞病變的作用，顯示其擁有良好的預(yù)防性抑制腺病毒和流感病毒感染的應(yīng)用價值。
　　二、 EGCG、單寧酸和黃芪多糖抑制病毒感染機(jī)制的初步研究
　　甲型H1N1流感病毒是有囊膜的分節(jié)段RNA病毒，而腺病毒是無囊膜的雙鏈DNA病毒，2種病毒的外形結(jié)構(gòu)和蛋白組成差別巨大，同時其在細(xì)胞內(nèi)的增殖

11、策略也完全不同，但2者均須克服具有相同結(jié)構(gòu)和功能特點細(xì)胞膜屏障，才能完成其有效感染和復(fù)制增殖過程，因此，宿主細(xì)胞膜應(yīng)是EGCG、單寧酸和黃芪多糖等植物化合物發(fā)揮其廣譜性干擾病毒侵染作用的理想靶標(biāo)之一。為深入探索此類植物化合物的作用機(jī)制，本研究針對病毒侵染時所引起的細(xì)胞膜病理性改變，EGCG、單寧酸和黃芪多糖存在時對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的影響，以及此類植物化合物的生物學(xué)效應(yīng)對病毒感染的干擾/拮抗作用等一系列數(shù)據(jù)和指標(biāo)，開展了相關(guān)的檢測和比較分

12、析。
　　1、通過細(xì)胞膜電位特異性熒光探針DiBAC4(3)的標(biāo)記，利用流式細(xì)胞熒光檢測技術(shù)，分析細(xì)胞膜電位變化的特點，結(jié)果顯示:宿主細(xì)胞分別被感染滴度為100 TCID50的5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒后，其細(xì)胞膜電位均呈下降趨勢，細(xì)胞膜的去極化率分別升高38.12％與83.91％。三種植物化合物存在時對細(xì)胞的膜電位均有不同程度的影響，尤其是EGCG，可使293A細(xì)胞和MDCK細(xì)胞的膜電位顯著升高，在640μg/ml的有效濃

13、度下，可使293A細(xì)胞和MDCK細(xì)胞的膜電位去極化率分別降低29.38％和43.76％。在EGCG存在的條件下，可明顯降低因病毒感染所導(dǎo)致的細(xì)胞膜電位升高的現(xiàn)象。尤其是在5型腺病毒感染前使用10μg/ml-640μg/ml濃度的EGCG干擾病毒感染時，宿主細(xì)胞膜去極化率降低1.31％-31.86％。Spearman雙變量等級相關(guān)分析也表明，只有在5型腺病毒感染前，使用EGCG預(yù)處理293A細(xì)胞，其對宿主細(xì)胞膜電位的干預(yù)作用與其抑制病毒感

14、染作用具有相關(guān)性(R=0.931，p＞0.05)。
　　2、通過DPH（1，6-Diphenyl-1，3，5-hexatriene）熒光探針的標(biāo)記，利用熒光偏振技術(shù)，檢測細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的熒光各向異性(r)的變化特點（注:細(xì)胞膜熒光各向異性r與細(xì)胞膜流動性成反比），結(jié)果顯示:宿主細(xì)胞分別被感染滴度為100 TCID50的5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒后，其細(xì)胞膜流動性顯著升高，敏感細(xì)胞的膜熒光各向異性分別降低了13.57％和1

15、5.76％。EGCG、單寧酸和黃芪多糖均可使293A和MDCK細(xì)胞的膜流動性不同程度的降低，在640μg/ml濃度下，此三種物質(zhì)可使293A細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高32.61％、25.75％和5.22％;使MDCK細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高36.56％、74.60％和3.37％。在病毒感染前、感染同時和感染后三種條件下，分別添加濃度為640μg/ml的三種植物化合物后，均能不同程度的降低因病毒感染而導(dǎo)致的宿主細(xì)胞膜流動性升高的病理性變

16、化，添加單寧酸時，293A細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高5.68％、5.08％和21.17％，MDCK細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高78.45％、75.50％和70.92％;添加EGCG時，可使293A細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高19.71％、2.26％和15.56％;于病毒感染前和感染后添加EGCG時，可使MDCK細(xì)胞膜熒光各向異性分別升高32.69％和34.82％;于病毒感染前添加黃芪多糖時，可使293A細(xì)胞膜熒光各向異性升高4.33％，于病

17、毒感染前和病毒感染同時添加時，可使MDCK細(xì)胞膜熒光各向異性升高1.00％和7.12％。Spearman雙變量等級相關(guān)分析結(jié)果也表明，EGCG和單寧酸在三種條件下，其對宿主細(xì)胞膜流動性的生物學(xué)效應(yīng)與其抑制病毒感染的作用有明顯的相關(guān)性。
　　EGCG，單寧酸具有顯著降低細(xì)胞膜流動性的生物學(xué)效應(yīng)，此種效應(yīng)可有效的拮抗因病毒感染而引起的細(xì)胞膜流動性升高的病理性變化，而這種拮抗效果與其抑制多種病毒感染的作用密切相關(guān)，顯示此類植物化合物對宿

18、主細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的功能性影響，是其具有廣譜性抑制病毒感染的重要機(jī)制之一。而對于宿主細(xì)胞膜電位的影響，是否是其具有廣譜性抑制病毒感染機(jī)制之一，還需要進(jìn)一步的研究。
　　綜上所述，在安全的使用濃度下，預(yù)防性先期使用EGCG和單寧酸等植物化合物，可以有效的抑制5型腺病毒和甲型H1N1流感病毒的感染，具有進(jìn)一步研發(fā)為廣譜性病毒感染抑制劑的巨大潛力，而深入研究此類植物化合物的細(xì)胞膜生物學(xué)效應(yīng)，為探索其廣譜性抑制病毒感染的機(jī)制奠定了堅實