綠茶茶多酚EGCG與肝細胞核受體FXRα-RXRα結合鑒定.pdf

1、乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝臟炎性疾病，在世界范圍內廣泛流行，感染HBV后后嚴重損害肝臟并引起其他器官損害及多種并發(fā)癥。目前世界上乙型肝炎的主要治療方法是抗病毒治療?？共《局委煹年P鍵在于抑制病毒的復制。實驗研究表明HBV在人體內復制依賴于肝細胞中的肝富集轉錄因子，其中法尼醇X受體(FXR)和視黃醇X受體(RXR)與HBV病毒增強子二區(qū)和核心啟動子（HBV ENⅡ&CP）復制轉錄有關系，進一步研究表明，F(xiàn)XR與RXR可以在被

2、各自的配體激活后形成異物二聚體和HBV結合，調控HBV增強子二區(qū)和核心啟動子的復制轉錄活性。FXR與RXR有望成為抑制HBV轉錄復制的新靶點。表沒食子兒茶素沒食子酸脂EGCG屬于茶多酚的一種，占兒茶素中60％左右。近年來研究表明EGCG可以抑制HBV的轉錄復制，初步試驗結果表明EGCG抑制HBV轉錄復制是通過結合FXRα、RXRα，調控其活性，抑制HBV轉錄復制。
　　本研究構建肝細胞核受體FXRα和RXRα的原核表達載體pET2

3、8a-FXRα/RXRα，并轉入大腸桿菌BL21（DE3）中，加IPTG誘導重組蛋白表達，表達產(chǎn)物經(jīng)Western Bloting鑒定確定為FXRα重組蛋白，純化復性重組蛋白，免疫兔子制備多克隆抗體。同時構建肝細胞核受體 FXRα、RXRα真核表達載體 pcDNA3.1-FXRα、pcDNA3.1-RXRα及 pGL-3-HBV ENⅡ& CP Luciferase報告基因質粒，共轉染 HEK293細胞，加入各自配體脫氧膽酸（Deoxy

4、cholic acid）、9-順式維甲酸（9-cis）、或與EGCG共同作用細胞，讀取細胞中熒光素酶的熒光值，分析FXR/RXR對HBV ENⅡ&CP的轉錄調控。結果顯示：只有FXR與RXR共同被配體激活后聯(lián)合上調HBV ENⅡ&CP的表達，EGCG可以抑制這一轉錄調控。
　　為進一步研究EGCG結合對象，采用氨基苯硼酸（PAB）瓊脂糖親和層析法分離EGCG結合蛋白，Western Bioting鑒定，結果顯示FXRα/RXRα都

5、與EGCG結合。DARTS（Drug affinity responsive target stability）實驗：用熱穩(wěn)定的嗜熱菌蛋白酶消化經(jīng)EGCG處理/未經(jīng)EGCG處理的細胞總蛋白，消化未與EGCG結合蛋白，Weatern Bloting實驗鑒定蛋白。結果顯示未消化蛋白為FXRα。因此，EGCG抑制HBV CP&ENⅡ轉錄復制，可能的途徑是通過與FXRα結合，改變其分子構象，使其不能與HBV基因的轉錄調控元件結合，因而不能啟動H