肝細(xì)胞核因子4α預(yù)防大鼠肝癌及其分子機制研究.pdf

1、[研究背景及目的] 原發(fā)性肝癌是世界第五大常見腫瘤之一，其死亡率在惡性腫瘤中為第三位。原發(fā)性肝癌患者中有85％到90％為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。雖然，在過去的幾十年中肝癌的診斷及治療已經(jīng)取得了很大的進步和突破，但由于慢性肝炎及肝硬化病人是肝癌的高危人群，所以肝癌的預(yù)防仍是全球關(guān)注熱點。 肝細(xì)胞核因子4(hepatocyte nuclear factor4，HNF4)是一種屬于

2、細(xì)胞核激素受體家族的轉(zhuǎn)錄因子，在分化成熟的肝細(xì)胞中高表達，其中HNF4α是HNF4的重要亞型。HNF4α參與維護肝細(xì)胞脂肪代謝、白蛋白合成、藥物解毒、能量代謝、膽汁酸合成等重要功能，也是調(diào)控上皮細(xì)胞表型表達的重要基因。近年的研究提示，HNF4α對上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)有重要的調(diào)控作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HNF4α可以促進肝癌細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞增

3、殖和體內(nèi)腫瘤生長。 EMT主要是指上皮細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞功能以及細(xì)胞粘附、遷移能力等方面獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EMT不僅在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中的起重要作用，而且腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后成瘤性明顯增強并獲得了干細(xì)胞特性，提示EMT與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。 Wnt/β-catenin信號通路在眾多組織中是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移的重要通路，在肝臟的各種生物學(xué)功能中同樣發(fā)揮著重要作用。β-catenin既

4、是細(xì)胞連接的重要組成部分，又是經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵信號分子。在肝臟纖維化及肝癌發(fā)生過程中，伴隨著EMT現(xiàn)象的出現(xiàn)，普遍存在Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，即β-catenin在細(xì)胞漿的聚集和/或核轉(zhuǎn)位。另外，在肝前體細(xì)胞及肝癌干細(xì)胞活化的過程中Wnt/β-catenin信號通路也起著重要的作用。 本課題將系統(tǒng)研究HNF4α對實驗性肝癌發(fā)生的預(yù)防作用，深入探討其生物學(xué)作用的分子機制，為應(yīng)用HNF4α防治肝癌的臨床

5、研究奠定實驗基礎(chǔ)。 [實驗方法] 一、HNF4α預(yù)防實驗性大鼠肝癌 1．利用AdEasyTM系統(tǒng)構(gòu)建表達HNF4α的重組腺病毒-AdHNF4α，293細(xì)胞包裝并反復(fù)感染，擴增高效表達HNF4α的AdHNF4α和空白對照病毒AdGFP，濃縮純化、測定滴度后保存。 2．AdHNF4α抑制DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌形成 雄性Wistar大鼠50只，正常對照組12只，其余DEN誘癌組共38只。第1組為正常對照組；

6、第2～4組予DEN溶液按70 mg/kg劑量腹腔注射，每周注射1次，連續(xù)注射10 W，制備DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型。其中第2組設(shè)為模型對照組；第3組為空白病毒AdGFP對照組；第4組設(shè)為AdHNF4α導(dǎo)入組。于DEN注射第10 w經(jīng)尾靜脈分別注入5×109pfu AdGFP和5×109pfu AdHNF4α，之后分別于第12 w、14 w、16 w、18 w及20 w經(jīng)尾靜脈給予注射相同滴度的病毒，并在10 w、11 w、15 w及18

7、 w每組隨機處死2只大鼠，在22 w處死剩余大鼠。分別觀察各組大鼠肝臟大體變化；HE染色觀察病理變化；免疫組織化學(xué)法測定α-SMA、AFP、PCNA表達；Masson’strichrome及Sirius Red染色測定ECM含量并對肝纖維化程度分級，圖象分析儀半定量分析。 二、HNF4α抑制肝細(xì)胞EMT和肝癌前體細(xì)胞產(chǎn)生的研究 1．Real time RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法，分別檢測正常、DEN誘癌大鼠肝組織HN

8、F4α及EMT相關(guān)基因(E-cadherin、vimentin、snail、TGF-β1)的表達；同時檢測HNF4α導(dǎo)入后HNF4α及EMT相關(guān)基因的表達。 2．免疫組織化學(xué)方法檢測10例人原發(fā)性肝癌標(biāo)本中HNF4α及EMT相關(guān)基因(E-cadherin、vimentin)的表達。 3．分離原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞，培養(yǎng)2d后，換成含有2 ng/ml TGF-β1無血清培養(yǎng)基，同時將AdGFP或AdHNF4α以感染復(fù)數(shù)(mul

9、tiplicity of infection，MOI)10感染肝細(xì)胞，動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化；收集感染48 h、72 h后細(xì)胞，抽提總RNA和蛋白。Real time RT-PCR法檢測肝細(xì)胞HNF4α、白蛋白(albumin，ALB)、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、snail、Ⅰ型膠原mRNA水平表達；細(xì)胞間接免疫熒光檢測EMT相關(guān)基因(E-cadherin、vimentin、snail)表達；

10、Western Blot檢測相應(yīng)蛋白水平變化。 4．免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠肝組織內(nèi)肝前體細(xì)胞/肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因(OV-6、EpCAM)的表達和分布情況。 三、HNF4α對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性的影響 1．利用報告基因檢測系統(tǒng)分析HNF4α在293T、HepG2和BRL中對β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的抑制。 2．通過核質(zhì)分離后利用Western blot方法檢測HNF4α對TGF-

11、β1激活的肝細(xì)胞β-catenin核轉(zhuǎn)位的調(diào)節(jié)。 3．免疫組織化學(xué)方法檢測各實驗組大鼠肝組織內(nèi)β-catenin的表達和分布情況。 [實驗結(jié)果] 一、HNF4α抑制實驗性大鼠肝癌發(fā)生 1．隨DEN誘癌進程，模型對照及病毒對照組大鼠逐漸出現(xiàn)肝纖維化、肝硬化及肝癌的病理表現(xiàn)。在誘癌第22 w，模型組及病毒對照組(6只/組)大鼠肝硬化明顯，全部出現(xiàn)癌結(jié)節(jié)，HNF4α組(6只/組)均沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤。 2．M

12、asson's trichrome及Sirius Red膠原染色結(jié)果半定量分析發(fā)現(xiàn)AdHNF4α組面積約為AdGFP組的49％(P＜0.05)，免疫組化表明α-SMA表達較AdGFP組均顯著下降(P＜0.05)。 3．免疫組化結(jié)果半定量分析，結(jié)果表明HNF4α組AFP及PCNA表達較AdGFP組顯著減少(P＜0.05)。 二、HNF4α抑制肝細(xì)胞EMT及肝癌前體細(xì)胞的產(chǎn)生 1．在DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌形成過程中HNF

13、4α及EMT相關(guān)指標(biāo)的變化：Real timeRT-PCR及免疫組織化學(xué)檢測提示隨肝纖維化及肝癌發(fā)生肝組織內(nèi)HNF4α表達逐漸下降；同時，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin較正常組明顯減少(P＜0.05)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物較正常組明顯增加(P＜0.05)。 2．HNF4α對DEN肝癌模型肝組織EMT相關(guān)基因表達影響：Real time RT-PCR及免疫組織化學(xué)檢測顯示AdHNF4α導(dǎo)入組E-cadherin表達較AdGFP導(dǎo)入組

14、及模型組顯著增加(P＜0.01)，而Snail、Vimentin表達均顯著減少(P＜0.05)。 3．將含有TGF-β1無血清培養(yǎng)基刺激原代大鼠肝細(xì)胞，48 h后可見較多死亡細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)由多邊形向梭形轉(zhuǎn)變；72 h后見死亡細(xì)胞進一步增多，活細(xì)胞數(shù)量較少且大多數(shù)呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞梭形形態(tài)。Real time RT-PCR及間接免疫熒光檢測Vimentin、Snail表達均明顯增強(P＜0.05)，而E-cadherin、HN

15、F4α表達明顯減少(P＜0.05)。 4．將MOI10的AdHNF4α和AdGFP分別感染TGF-β1刺激的原代大鼠肝細(xì)胞，48 h后AdHNF4α組細(xì)胞死亡數(shù)量較AdGFP組明顯減少，細(xì)胞形態(tài)仍保持多邊形；72 h后AdGFP組活細(xì)胞數(shù)量較少且大多數(shù)呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞梭形形態(tài)，AdHNF4α組細(xì)胞死亡細(xì)胞很少且大多仍保持多邊形形態(tài)。Real time RT-PCR檢測AdHNF4α組HNF4α表達明顯上調(diào)，Vimentin和Snai

16、l表達均明顯減少(P＜0.05)，E-cadherin明顯增加(P＜0.05)。 5．AdHNF4α組肝前體/肝瘤干細(xì)胞OV-6及EpCAM陽性細(xì)胞比例較AdGFP組明顯減少(P＜0.05)。 三、HNF4α下調(diào)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性 1．AdHNF4α可以明顯抑制293T和HepG2細(xì)胞β-catenin報告基因的活化，并隨著AdHNF4α的滴度增加逐漸增強，即呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

17、 2．AdHNF4α可明顯抑制由TGF-β1刺激引起肝細(xì)胞β-catenin的核內(nèi)轉(zhuǎn)位，從而抑制Wnt/β-catenin通路的活化。 3．免疫組織化學(xué)檢測提示DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌形成過程中，肝細(xì)胞膜上β-catenin逐漸減少并出現(xiàn)胞漿和/或核內(nèi)聚集，AdHNF4α組較AdGFP組β-catenin的核轉(zhuǎn)位明顯減少(P＜0.05)。 [結(jié)論] 1．實驗性大鼠肝硬化、肝癌進程及人肝癌的發(fā)生過程中，肝細(xì)胞HNF4α