APE1乙酰化調(diào)節(jié)Beclin1依賴的細(xì)胞自噬提高放療敏感性.pdf

1、本文主要講述了以下幾個(gè)方面：
　　第一部分:APE1乙?；{(diào)節(jié)電離輻射誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞自噬
　　研究背景:放射治療是晚期腫瘤主要的治療手段，但放療抵抗的現(xiàn)象普遍存在。APE1/Ref-1，DNA損傷修復(fù)和氧化還原(redox)雙功能基因，作為提高放射治療敏感性的靶點(diǎn)已經(jīng)被廣泛證實(shí)，但具體機(jī)制還在探索中。APE1是一個(gè)多功能蛋白，具有氧化還原一些轉(zhuǎn)錄因子（如P53、AP-1、PTEN、NF-kb等）和DNA堿基損傷修復(fù)的功能

2、。乙?；⒘姿峄?、泛素化都是APE1翻譯后修飾的方式，但APE1乙酰化修飾尤為重要。APE1的N末端有多個(gè)位點(diǎn)能被乙?；D(zhuǎn)移酶修飾，尤其K6/K7位點(diǎn)的乙?；揎椗cAPE1多種活性密切相關(guān)，如與nCaRE序列、YB-1介導(dǎo)的MDR1基因激活和BER功能密切相關(guān)。自噬是細(xì)胞的一種適應(yīng)性反應(yīng)，應(yīng)激刺激時(shí)細(xì)胞自我吞噬和降解細(xì)胞內(nèi)的長壽蛋白和細(xì)胞器，從而維持細(xì)胞存活。細(xì)胞自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療存在密切的關(guān)系。為了探索APE1乙酰化與電離輻

3、射(Ionizing Radiation IR)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬之間的關(guān)系，我們利用IR處理，觀察Hela細(xì)胞APE1乙酰化水平、細(xì)胞自噬水平的變化及可能的機(jī)制，為APE1作為放射治療的的靶點(diǎn)提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。
　　研究目的:探討脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子(apurinic/aprimidinicendonuclease/redox factor-1，APE1/Ref-1)乙?；瘜﹄婋x輻射誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作

4、用。
　　研究方法:給予Elekta precise直線加速器處理Hela細(xì)胞0、2、4Gy照射24小時(shí)，或2Gy照射0、6、24、48小時(shí)后，應(yīng)用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)的方法檢測APE1乙?；揎椉癇eclin1/Bcl2的結(jié)合，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞自噬的水平，免疫熒光激光共聚焦檢測LC3的聚集，Western blot檢測APE1、LC3和p62的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:Hel

5、a細(xì)胞APE1乙?；诫S著照射劑量的增加和照射后時(shí)間的延長而逐漸升高（P＜0.05）。Hela細(xì)胞LC3Ⅱ的表達(dá)與照射劑量正相關(guān)，而與P62呈負(fù)相關(guān)（P.＜0.05）:電離輻射促進(jìn)細(xì)胞的自噬水平和LC3的聚集。電離輻射后，LC3Ⅱ上調(diào);與對照組APE1WT相比，APE1K6R/K7R細(xì)胞Beclin1/Bcl2結(jié)合增強(qiáng)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低，P62表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:APE1乙?；ㄟ^Beclin1/

6、Bcl2途徑調(diào)節(jié)電離輻射誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞自噬。
　　第二部分:genistein調(diào)節(jié)Beclin1依賴的細(xì)胞自噬促進(jìn)放療敏感性
　　研究背景:放射治療最近把提高輻射精度，降低腫瘤發(fā)病率，減少對腫瘤組織劑量不足和對正常組織劑量過大機(jī)率考慮在內(nèi)。為了更好達(dá)到腫瘤治療的目的，放射治療的輔助用藥應(yīng)運(yùn)而生。Genistein是黃豆天然產(chǎn)物大豆異黃酮的主要成分，一些體內(nèi)體外研究證實(shí)，在前列腺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，胃癌，肺癌，胰腺癌，淋巴

7、瘤中具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)。Genistein明顯的提高腫瘤放射治療的療效，也能減輕放射治療對正常組織引起的炎性損傷。Genistein能夠提高化學(xué)治療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬水平，其具體機(jī)制還不清楚。
　　Bcl-xl是bcl2家族的成員，與bcl-2蛋白均是抗凋亡蛋白的成員之一，bcl-xl在肺癌細(xì)胞中表達(dá)高于bcl-2。Bcl-xl的在前列腺癌細(xì)胞中的高表達(dá)和下調(diào)直接影響pc-3細(xì)胞對治療的敏感性。Bcl-xl與線粒體穩(wěn)定的結(jié)合，

8、抑制凋亡蛋白與線粒體的結(jié)合而抑制凋亡的發(fā)生;bcl-2家族抗凋亡蛋白定位于細(xì)胞核，主要是通過下調(diào)堿基切除修復(fù)酶APEI并與DNA修復(fù)酶APE1、XRCC1、c-Myc等相互結(jié)合抑制酶的活性抑制堿基切除修復(fù)。大量研究證實(shí)，Genistein抑制腫瘤細(xì)胞G2/M期促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，也促進(jìn)肺部腫瘤放射治療和化學(xué)治療誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平。Bcl-xl蛋白主要定位在線粒體膜，維持線粒體的穩(wěn)定、阻止細(xì)胞色素C的釋放和caspase蛋白的激活，發(fā)揮抗

9、凋亡的功能?，F(xiàn)在證據(jù)表明bcl-xl蛋白也定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞核，并發(fā)揮一定的功能。Bcl-xl和Beclin1之間通過BH3區(qū)域相互結(jié)合組成的復(fù)合物是自噬調(diào)控的一個(gè)開關(guān)。
　　自噬是一個(gè)細(xì)胞自我分解的過程，細(xì)胞把要降解和循環(huán)利用長壽蛋白和細(xì)胞器吞入溶酶體進(jìn)行降解，降解的細(xì)胞器有線粒體，過氧化物酶體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在機(jī)體處于饑餓和應(yīng)激的正常情況下，自噬是有利于細(xì)胞存活的;但是越來越多的證據(jù)表明自噬過度刺激或始終激活，自噬也是促進(jìn)細(xì)胞死亡的

10、程序。細(xì)胞自噬水平的過高或過低都不利細(xì)胞存活，許多抗腫瘤治療大多是誘導(dǎo)自噬發(fā)生。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的紊亂可在治療抵抗的腫瘤中普遍存在，幾乎所有的腫瘤都能維持凋亡的核心調(diào)控機(jī)制。
　　Genistein促進(jìn)腫瘤治療誘導(dǎo)的凋亡水平，單用和聯(lián)用genistein明顯的抑制細(xì)胞漿內(nèi)的bcl-xl的蛋白量。對于bcl2抗凋亡家族蛋白高表達(dá)的肺部腫瘤，genistein通過多種機(jī)制促進(jìn)凋亡的發(fā)生。抗凋亡蛋白bcl-2家族與Beclin1結(jié)合發(fā)揮抗自

11、噬活性，也是維持細(xì)胞存活的途徑。改變抗細(xì)胞調(diào)往的bcl-2家族蛋白的入核情況和與Beclin1之間結(jié)合是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性凋亡的機(jī)制之一。
　　研究目的:探索Genistein引起NSCLC細(xì)胞中Bcl-xl亞細(xì)胞定位的改變與IR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、自噬之間的關(guān)系，為提高放射治療敏感性、減輕放射治療損傷反應(yīng)提供可靠的輔助手段。
　　研究方法:利用細(xì)胞漿細(xì)胞核蛋白提取試劑盒分別提取核漿蛋白;通過westernBlot的方法檢測各種凋亡

12、自噬標(biāo)志蛋白表達(dá);用免疫熒光的方法檢測A549細(xì)胞Bcl-xl亞細(xì)胞定位的改變;流式細(xì)胞儀是在細(xì)胞水平檢測凋亡和自噬水平。
　　研究結(jié)果:肺癌細(xì)胞系胞漿Bcl-xl蛋白含量的差異影響IR誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞抗凋亡能力;Genistein改變A549細(xì)胞Bcl-xl蛋白的亞細(xì)胞定位，抑制IR誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)，促進(jìn)Bcl-xl/Beclin1復(fù)合物的解離提高細(xì)胞的白噬水平，促進(jìn)Bcl-2家族相關(guān)的多重凋亡途徑，而且NSCL