Beclin1基因增強三陰性乳腺癌細(xì)胞BT-549對多柔比星的敏感性.pdf

1、研究背景:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有130萬人被診斷為乳腺癌，約40萬人死于該病。隨著生活環(huán)境、生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，世界各地乳腺癌的發(fā)病率明顯上升，并呈年輕化的趨勢。在我國過去的十年中，乳腺癌發(fā)病率上升了27％，其中40％的患者在5年內(nèi)的死亡率呈現(xiàn)出接近西方的態(tài)勢。在京津滬等大城市，乳腺癌患病率已居女性惡性腫瘤之首。乳腺癌業(yè)已成為威脅婦女生命和健康的頭號殺手。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對乳腺癌的認(rèn)識變

2、得越來越深入:乳腺癌是一種生物學(xué)特征高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，根據(jù)組織學(xué)、免疫組化及分子生物學(xué)技術(shù)可將其分為不同的亞型。
　　 三陰性乳腺癌(TNBC）是指ER、PR、Her-2都為陰性的乳腺癌，約占所有乳腺癌類型的10-17％左右。隨著對TNBC的了解不斷深入，現(xiàn)已明確其生物學(xué)特性有別于其它類型的乳腺癌。目前對TNBC的研究多從basal-like乳腺癌入手，原因在于多數(shù)TNBC具有basal-like乳腺癌表現(xiàn):侵襲性強，淋巴細(xì)

3、胞多呈陽性，核分裂相等級高，有絲分裂計數(shù)多，腫瘤細(xì)胞壞死，腫瘤中間形成硬化灶等。學(xué)者Nielsen利用免疫組化研究發(fā)現(xiàn):basal-like乳腺癌中ER、Her-2陰性，但表達(dá)細(xì)胞角蛋白(cytokeratin)、CK5/6及表皮生長因子受體(EGFR)。CK5/6為表達(dá)于正常基底或者肌上皮乳腺組織的高分子量細(xì)胞角蛋白，被認(rèn)為是鑒定basal-like乳腺癌最有效的標(biāo)志。basal-like乳腺癌其它的生物學(xué)標(biāo)志還有CK14，CK17，

4、p53，平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin)，c-kit、鈣聯(lián)蛋白(P-cadherin)等。一些研究顯示，至少有25％的TNBC發(fā)生BRCA1的有害突變，而其它類型的乳腺癌只有2％發(fā)生BRCA1突變，這些研究證據(jù)表明了BRCA1突變與TNBC之間的關(guān)聯(lián)。雖然大多數(shù)basal-like乳腺癌是TNBC，但不能籠統(tǒng)認(rèn)為兩者是一種類型，因為basal-like乳腺癌有時候會表達(dá)ER、PR或Her-2，且TNBC有時也不會

5、表達(dá)基底樣標(biāo)志。
　　 目前TNBC的治療策略主要有:化療、放療、基因治療及靶向藥物治療。繼續(xù)探索TNBC的治療方法將是乳腺癌研究的一個重點方向。
　　 TNBC中多種腫瘤抑制因子缺失，其中包括Beclin1基因。Beclin1基因包含12個外顯子，長度從61至794 bp;內(nèi)含子長度從106 bp至2 kbp。完整的Beclin1基因序列編碼2098bp轉(zhuǎn)錄子，包含120-bp5'UTR，1353-bp編碼區(qū)和625-

6、bp3'UTR，其mRNA編碼60kDa大小的蛋白，此蛋白能與凋亡抑制劑Bcl-2相互作用。
　　 Beclin1含Bcl-2同源區(qū)(BH3)，卷曲螺旋區(qū)(CCD)及進(jìn)化保守區(qū)(ECD)，這些區(qū)域能夠結(jié)合不同的蛋白。通過ECD，Beclin1能結(jié)合磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，Vps34，從而募集更多的Atg蛋白，調(diào)節(jié)自噬溶酶體的形成。通過BH3，Beclin1能結(jié)合Bcl-2/Bcl-XL，從而形成Bcl-2/Bcl-XL-B

7、eclin1復(fù)合物(Bcl-2通過抑制凋亡的誘導(dǎo)而促進(jìn)細(xì)胞的生存，其在多種腫瘤中過表達(dá))，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡?；诖?，Beclin1基因可雙重調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬及凋亡。
　　 哺乳類細(xì)胞過表達(dá)Beclin1基因時，能調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。自噬可通過與凋亡不同的降解機(jī)制（膜泡降解）和分子機(jī)制（特定基因的激活），使細(xì)胞程序性死亡，可作為第二種程序性細(xì)胞死亡。
　　 當(dāng)前多從自噬角度探討B(tài)eclin1基因與各種腫瘤的關(guān)系，其在多種人類癌癥中表

8、達(dá)下調(diào)，包括75％的卵巢癌，50％的乳腺癌、40％的前列腺癌、結(jié)直腸癌等。學(xué)者Liang利用Western blot技術(shù)分析了乳腺癌來源的細(xì)胞系、正常乳腺組織及來源于侵襲性散發(fā)乳腺癌的組織。分析了11種乳腺癌細(xì)胞系，其中只有3種乳腺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了Beclin1基因。在17例正常乳腺組織及對照的乳腺癌組織中，15例正常組織檢測到了高水平的Beclin1基因表達(dá)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于癌組織。而與之相反的是，16例癌組織中發(fā)現(xiàn)了對照蛋白的高表達(dá)，而正常組織

9、則無如此表現(xiàn)，Beclin1在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)。
　　 從凋亡角度研究Beclin1基因與腫瘤的關(guān)系較少。學(xué)者Furuya發(fā)現(xiàn)人類胃癌細(xì)胞MKN28過表達(dá)Beclin1能夠促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡，用RNA干擾技術(shù)沉默MKN1細(xì)胞系中Beclin1基因的表達(dá)，則能減輕細(xì)胞毒性，與此同時，caspase-9活性的增加。因此，Beclin1通過caspase-9來促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。他們的研究表明Beclin1可作為一個促凋

10、亡分子。
　　 Beclin1能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的自噬，然而，Beclin1作為促凋亡分子的作用仍然不明確，特別是在TNBC中。基于以上認(rèn)識，探索Beclin1基因與TNBC的關(guān)系，將為TNBC的治療帶來新的策略。
　　 目的:自噬基因Beclin1的缺失與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等。當(dāng)前的研究表明Beclin1基因調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，自噬通過限制染色體的不穩(wěn)定性，阻止致癌突變的累積;減輕低氧應(yīng)激以及減

11、少瘤內(nèi)的壞死和炎癥來對抗癌變，使腫瘤細(xì)胞程序性死亡（有別于凋亡）。但對于Beclin1基因的促凋亡作用研究很少（目前能夠檢索到的相關(guān)文獻(xiàn)只有:Beclin1基因能夠通過caspase-9促進(jìn)化療藥物順鉑及多柔比星誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡）。對于Beclin1基因能否促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的凋亡暫未見報道。因此本研究旨在探討三陰性乳腺癌細(xì)胞BT-59中Beclin1基因過表達(dá)對癌細(xì)胞增殖，以及Beclin1基因?qū)Χ嗳岜刃黔h(huán)境下生長的BT-549細(xì)胞

12、的影響。
　　 方法:
　　 (1)檢測多柔比星對BT-549細(xì)胞的半抑制濃度:設(shè)置5個不同的多柔比星濃度，向正常環(huán)境下生長的BT-549細(xì)胞中加入各個濃度的多柔比星5μl，利用MTT方法測量每個濃度下的光密度值，然后計算半抑制濃度;
　　 (2)利用脂質(zhì)體法將pDsRed-C1-Beclin1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人三陰性乳腺癌BT-549細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pDsRed-C1作為對照組;
　　 (3)本實驗細(xì)胞分為

13、3組:①空白組:只接種細(xì)胞，不做任何處理;②陰性對照組:將空載質(zhì)粒pDsRed-C1轉(zhuǎn)染人三陰性乳腺癌BT-549細(xì)胞株;③Beclin1組:將目的質(zhì)粒pDsRed-C1-Beclin1轉(zhuǎn)染人三陰性乳腺癌BT-549細(xì)胞株。每組細(xì)胞的生長環(huán)境分為正常環(huán)境及多柔比星處理下的環(huán)境（于轉(zhuǎn)染后4-6h加多柔比星處理）;
　　 (4)吖啶橙(AO)染色檢測正常生長環(huán)境下BT-549細(xì)胞自噬的變化:細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長至60-80％

14、融合度后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液中72h。棄去各組培養(yǎng)液，予PBS洗滌細(xì)胞兩次后，于避光環(huán)境下加入0.1g/L吖啶橙溶液兩滴染色，并于37℃培養(yǎng)箱中避光孵育15min后顯微鏡下觀察染色情況;
　　 (5) MTT法分析外源性Beclin1基因過表達(dá)對兩種環(huán)境下生長的BT-549細(xì)胞增殖影響:細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞長至60％-80％融合后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于1

15、0％FBS的1640培養(yǎng)液內(nèi)，分別于不同時間點向各樣本內(nèi)加入MTT溶液（濃度5mg/ml）20μl，吸去上清后，每孔加入150μl DMSO，充分混勻后于多功能酶標(biāo)儀上檢測各組細(xì)胞490nm的光密度值;
　　 (6) RT-PCR法檢測兩種環(huán)境下各組細(xì)胞Beclin1 mRNA的表達(dá):細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長至80％融合度后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液中72h。收集各組細(xì)胞RNA

16、，測定濃度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢后將膠置入凝膠成相系統(tǒng)中觀察;
　　 (7) Western blot法檢測兩種環(huán)境下各組細(xì)胞蛋白的表達(dá);細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染完畢后繼續(xù)用全培培養(yǎng)72h，收集各組細(xì)胞中的蛋白（多柔比星環(huán)境下生長的細(xì)胞，培養(yǎng)液中的細(xì)胞蛋白也要收集），測定各組蛋白濃度后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后加入一抗及二抗顯色，并在顯影儀上觀察顯色結(jié)果;
　　 (8)流式細(xì)胞儀檢測兩種

17、環(huán)境下BT-549細(xì)胞凋亡及周期情況:BT-549細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)72h。胰酶消化細(xì)胞后，離心收集各組細(xì)胞，棄去上清，避光環(huán)境下向各樣品中加入Binding Buffer重懸細(xì)胞，依次加入AnnexinV-FITC和PI，將各樣品置于冰上，于1小時內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測凋亡。用EP管離心收集6孔板中的各組細(xì)胞，每組加入70％的乙醇于-20℃下固定過夜，取出乙醇固定過的細(xì)胞，離心去上清，冷PBS洗2遍。加入4001μl的

18、PBS，40μl的RNA酶室溫孵育30min，再加入60μl的PI染色，4℃孵育30min，于流式細(xì)胞儀上檢測周期。
　　 (9)統(tǒng)計學(xué)方法:細(xì)胞增殖采用重復(fù)測量方差分析方法;其余組間差異顯著性用one-way ANOVA方法分析;方差齊性用Levene檢驗:滿足方差齊性用LSD檢驗;不滿足方差齊性用Dunnett'T3檢驗。顯著性水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 (1)正常生長環(huán)境及多柔比星處理后，真核表

19、達(dá)質(zhì)粒pDsRed-C1-Beclin1明顯促進(jìn)BT-549細(xì)胞Beclin1 mRNA及蛋白的表達(dá)。多柔比星處理前各組細(xì)胞Beclin1 mRNA表達(dá)情況:Beclin1組相對灰度值為（0.70±0.03），高于陰性對照組（0.34±0.04）及空白組（0.32±0.07）。多柔比星處理后各組細(xì)胞Beclin1 mRNA表達(dá)情況:Beclin1組mRNA的相對灰度值為（0.76±0.07），亦高于（0.33±0.05）及空白組（0.2

20、9±0.05）;
　　 (2)經(jīng)MTT法測得多柔比星對BT-549細(xì)胞的半抑制濃度為1.4μg/ml;
　　 (3)多柔比星處理前，各組細(xì)胞增殖曲線呈上升型，但Beclin1組較另外兩組平緩的多[各組細(xì)胞96h的OD值為:Beclin1組(1.73±0.27)，陰性對照組(2.65±0.32)及空白組(2.71±0.22)。各P＜0.05]，Beclin1基因抑制了BT-549細(xì)胞的增殖;多柔比星處理后，各組細(xì)胞增殖曲線

21、呈下降趨勢，但Beclin1組下降更快[96h的OD值為:Beclin1組(0.08±.05)，陰性對照組(0.35±0.14)及空白組(0.41±0.08)。各P＜0.05];
　　 (4)多柔比星處理前各組細(xì)胞凋亡率為:Beclin1組（8.81±1.45）％，明顯高于陰性對照組（3.06±0.31）％及空白組（2.87±0.18）％(P＜0.05)，Beclin1基因能促進(jìn)BT-549細(xì)胞凋亡;多柔比星處理后各組細(xì)胞凋亡率

22、為:Beclin1組（14.3±1.09）％，陰性對照組（4.81±0.7）及空白組（4.58±0.7）％(P＜0.05)，同樣的條件下，轉(zhuǎn)染pDsRed-C1-Beclin1的細(xì)胞凋亡率更高，因此，Beclin1基因能增強BT-549細(xì)胞對多柔比星的敏感性;
　　 (5)細(xì)胞周期分析顯示，無論多柔比星處理與否，轉(zhuǎn)染pDsRed-C1-Beclin1質(zhì)粒，處于G1期的BT-549細(xì)胞明顯高于另外兩組細(xì)胞，Beclin1基因能抑制

23、的BT-549細(xì)胞的有絲分裂;
　　 (6)正常環(huán)境下，AO染色觀察到了轉(zhuǎn)染pDsRed-C1-Beclin1的細(xì)胞中有紅色斑點的酸性膜泡的出現(xiàn)，而另外兩組則無此現(xiàn)象，表明Beclin基因可促進(jìn)細(xì)胞自噬。
　　 結(jié)論:
　　 (1)吖啶橙染色中，轉(zhuǎn)染pDsRed-C1-Beclin1的細(xì)胞出現(xiàn)嗜酸性紅色膜泡，因此Beclin1基因能調(diào)控BT-549細(xì)胞的自噬;
　　 (2)三陰性乳腺癌細(xì)胞BT-549過表