溫?zé)釕?yīng)激調(diào)節(jié)自噬性死亡增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480對(duì)放療的敏感性.pdf

1、第一部分溫?zé)釕?yīng)激通過促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生ROS增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480對(duì)放療的敏感性研究
　　結(jié)直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者就診時(shí)已處于進(jìn)展期，臨床療效較差[1,2]。放療在結(jié)直腸癌的綜合治療中起著越來越重要的作用，術(shù)前放療可提高結(jié)直腸癌患者的手術(shù)根治切除率，提高低位結(jié)腸癌患者的保肛率，減少術(shù)后局部復(fù)發(fā)的機(jī)會(huì)[3-5]。然而，由于腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感性的差異，放療的效果也不同，部分接受手術(shù)及術(shù)前輔助放療的患者仍然容易出現(xiàn)復(fù)

2、發(fā)轉(zhuǎn)移[6]。臨床研究表明，熱療可增強(qiáng)放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的殺傷作用，提高結(jié)直腸癌的放療療效，但其確切的機(jī)制尚不明確[7-9]。本課題通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究溫?zé)釕?yīng)激促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，探討溫?zé)釕?yīng)激對(duì)放療的增敏作用機(jī)制。
　　目的：
　　研究溫?zé)釕?yīng)激通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生ROS增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480對(duì)放療的敏感性在殺傷腫瘤細(xì)胞中的

3、作用。
　　方法：
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：將結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480分為5組：①空白對(duì)照組；②熱療組（43℃）；③放療組（6Gy）；④熱療+放療組（43℃+6Gy）；⑤熱療+放療+N-乙酰半胱氨酸組（43℃+6Gy+NAC）。各組細(xì)胞處理完成后，光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞的生長狀態(tài)；流式雙染檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況、應(yīng)用流式細(xì)胞儀（FCMs）檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量及線粒體膜電位。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建裸鼠左腹股溝皮下移植瘤模

4、型，然后將成功構(gòu)建左腹股溝皮下移植瘤的裸鼠隨機(jī)分為5組，每組六只（n=6），分別為：①control組；②熱療組；③放療組；④熱療+放療組；⑤熱療+放療+N-乙酰半胱氨酸（NAC）組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)小鼠，切除腫瘤組織，測(cè)量腫瘤體積大小的改變情況，一部分腫瘤組織采用TUNEL觀察腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況；另一部分制成細(xì)胞懸液，F(xiàn)CMs檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的含量及線粒體膜電位。
　　結(jié)果：
　　1.顯微鏡下觀

5、察不同處理對(duì)細(xì)胞的殺傷效果，結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的生長速度緩滯，細(xì)胞形態(tài)傾向于梭形或變圓，并且出現(xiàn)漂浮的死亡細(xì)胞；直觀的觀察到不同處理對(duì)細(xì)胞的殺傷效果，其中放療組出現(xiàn)漂浮死亡的細(xì)胞多于熱療組；熱療+放療組細(xì)胞生長最慢，漂浮死亡的細(xì)胞數(shù)最多；熱療+放療+NAC組出現(xiàn)漂浮死亡的細(xì)胞與熱療+放療組相比有所減少。
　　2.流式雙染檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示：與對(duì)

6、照組相比，放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組各種處理均能促進(jìn)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；放療組細(xì)胞的凋亡率高于熱療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；熱療+放療組細(xì)胞的凋亡率明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。熱療+放療+NAC組細(xì)胞的凋亡率低于熱療+放療組，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　3.FCMs檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比

7、，放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組細(xì)胞內(nèi)ROS水平出現(xiàn)不同程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；放療組細(xì)胞內(nèi)ROS水平高于熱療組，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；熱療+放療組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯高于其它組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；熱療+放療+NAC組ROS的水平與熱療+放療組相比明顯降低，兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。
　　4.FCMs檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位的變化，結(jié)果顯示

8、：與對(duì)照組相比，放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組細(xì)胞線粒體膜電位出現(xiàn)不同程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；放療組細(xì)胞線粒體膜電位下降水平高于熱療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；熱療+放療組細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降程度最明顯，明顯高于其它組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；熱療+放療+NAC組細(xì)胞線粒體膜電位下降水平低于熱療+放療組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　5.游標(biāo)卡尺測(cè)量各

9、組裸鼠移植瘤體積變化，結(jié)果顯示：接種結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞12天后裸鼠皮下移植瘤體積可達(dá)到500mm3，之后各組給予不同處理，每三天測(cè)量一次裸鼠移植瘤體積，與對(duì)照組相比，放療組、熱療組、熱療+放療組及熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤體積增長出現(xiàn)不同程度減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；放療組裸鼠移植瘤體積小于熱療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；熱療+放療組移植瘤體積小于其它各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；熱療+放療+

10、NAC組移植瘤大于熱療+放療組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　6.FCMs檢測(cè)各組裸鼠移植瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致：放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；放療組裸鼠移植瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平高于熱療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；熱療+放療組裸鼠移植瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯高于其它組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）

11、；熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平低于熱療+放療組，兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。
　　7.FCMs檢測(cè)各組裸鼠移植瘤細(xì)胞線粒體膜電位的變化，結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致：放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細(xì)胞線粒體膜電位出現(xiàn)不同程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；放療組裸鼠移植瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降水平高于熱療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；熱療+放療組裸鼠移植瘤細(xì)胞線粒體膜

12、電位下降程度最明顯，明顯高于其它組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降水平低于熱療+放療組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　8.TUNEL檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明：熱療組、放療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡水平高于對(duì)照組，熱療+放療組裸鼠移植瘤細(xì)胞的凋亡水平明顯高于其它組；熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細(xì)胞的凋亡水平低于