hAMSCs對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本課題擬通過(guò)體外分離、培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞,研究其對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的抑制作用,并初步研究其能否在體外誘導(dǎo)分化為眼表細(xì)胞,為用于翼狀胬肉的眼表修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、使用兩步酶消化法分離hAMSCs,胰酶-EDTA消化去除羊膜上皮細(xì)胞,膠原酶Ⅳ消化分離hAMSCs。流式細(xì)胞分析法鑒定hAMSCs表面抗原分子,分化培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞鑒定其分化能力。
　　2、使用Tr

2、answell共培養(yǎng)體系將hAMSCs與hPFs共培養(yǎng),免疫熒光化學(xué)法及Wester-Blot法檢測(cè)hPFs中α-SMA的表達(dá),同時(shí)行移行分析評(píng)估hAMSCs對(duì)hPFs移行的影響。
　　3、將hAMSCs與hBCFs在Transwell體系中共培養(yǎng),通過(guò)檢測(cè)hAMSCs細(xì)胞角蛋白19的表達(dá)水平評(píng)價(jià)其向眼表細(xì)胞分化的程度,通過(guò)檢測(cè)hAMSCs的α-SMA表達(dá)水平評(píng)價(jià)其分化機(jī)制與間質(zhì)上皮化過(guò)程的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1

3、、本實(shí)驗(yàn)方法分離hAMSCs體外貼壁生長(zhǎng),呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣,在體外能傳代生長(zhǎng),經(jīng)傳代培養(yǎng)的hAMSCs表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞表面抗原分子CD44、CD73與CD90,不表達(dá)白細(xì)胞抗原CD45。經(jīng)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周后,其分化所得的細(xì)胞行茜素紅S染色為紅色;經(jīng)間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)1～2周后,行油紅O染色為亮紅色。
　　2、行共培養(yǎng)后,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分析顯示hPFs的α-SMA表達(dá)水平明顯降低,相同的結(jié)果

4、通過(guò)Western-Blot分析得到證實(shí),移行分析顯示在移行分析的24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí),共培養(yǎng)組中hPFs的移行速度明顯慢于非共培養(yǎng)組。
　　3、與hBCFs共培養(yǎng)一周后,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法顯示hAMSCs的α-SMA表達(dá)水平顯著降低,并且部分hAMSCs的CK19表達(dá)陽(yáng)性。
　　結(jié)論：
　　1、采用兩步酶消化法能獲得hAMSCs,所分離的細(xì)胞能在體外貼壁生長(zhǎng)、穩(wěn)定傳代。
　　2、hAMSCs表面分子CD