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文檔簡介
1、目的:
通過利用脂多糖(LPS)刺激體外培養(yǎng)的表型為CD90+及CD90-的甲狀腺相關(guān)眼病(TAO)患者的眼眶成纖維細胞,比較相同濃度的脂多糖對不同CD90表型的眼眶成纖維細胞增殖情況的影響以及其炎性因子表達的作用,初步探討LPS在甲狀腺相關(guān)眼病中引起脂肪增殖中的機制。
方法:
(1)原代培養(yǎng)6例TAO患者的脂肪/結(jié)締組織來源的眼眶成纖維細胞,隨機分成7組,分別采用0 ng/ml,50 ng/ml,100
2、ng/ml,200 ng/ml,500 ng/ml,1000 ng/ml,2000 ng/ml LPS進行刺激。CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒檢測各組眼眶成纖維細胞增殖情況,探索最佳刺激濃度;
(2)利用流式細胞儀進行分選,篩選出CD90-成纖維細胞;
(3)構(gòu)建CD90過表達慢病毒,轉(zhuǎn)染CD90-細胞;將細胞分為A(空白病毒)、B(CD90過表達病毒)兩組,每組用摸索得到的最佳LPS濃度
3、進行刺激。CCK-8試劑盒檢測各組眼眶成纖維細胞增殖情況;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)、Western-blot法檢測各組CD90基因及蛋白的表達,并使用RT-PCR檢測各組IL-6、IL-1及TNF-α的表達量。
結(jié)果:
(1)TAO患者眼眶成纖維細胞體外培養(yǎng)成功,成功分選出表型為CD90-的眼眶成纖維細胞,在LP
4、S濃度為500 ng/ml時,成纖維細胞增殖20%,為最佳刺激濃度。
(2)成功制備過表達CD90的慢病毒,并轉(zhuǎn)染CD90-眼眶成纖維細胞。
(3)以500 ng/ml LPS刺激眼眶成纖維細胞后,對照組及CD90過表達組間的細胞增殖沒有明顯變化;同等濃度LPS刺激CD90-眼眶成纖維細胞后,IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌增多,CD90過表達組眼眶成纖維細胞IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌減弱,有統(tǒng)計學(xué)
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