HIF-1a誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞去分化及轉(zhuǎn)移作用及其靶向成像研究.pdf

1、胰腺癌（Pancreatic cancer）在腫瘤導(dǎo)致死亡中位居第四位，具有進(jìn)展迅速、轉(zhuǎn)移早、放化療抵制等特點(diǎn)。目前，胰腺癌基礎(chǔ)及臨床相關(guān)研究雖然獲得了一些進(jìn)展，但五年生存率仍維持在5％左右。針對(duì)胰腺癌的有效診療手段仍然任重而道遠(yuǎn)。探索胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程及其確切機(jī)制，仍然是當(dāng)前胰腺癌基礎(chǔ)及臨床研究的重點(diǎn)、難點(diǎn)。研究表明：應(yīng)激（缺氧、乏養(yǎng)、放化療）誘導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。病理研究顯示：作為一種乏血供腫瘤組織

2、，胰腺癌組織中存在大面積的低氧乏氧區(qū)。近年來(lái)，低氧誘導(dǎo)因子-1（Hyopxia induced factor-1）在實(shí)體瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用引起了越來(lái)越多的關(guān)注。針對(duì)胰腺癌的大規(guī)模臨床標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：HIF-1a表達(dá)水平與胰腺癌預(yù)后呈高度負(fù)相關(guān)，是誘導(dǎo)腫瘤增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸的關(guān)鍵分子。然而，其確切機(jī)制尚未完全闡明。
　　本研究目的：
　　(1)明確低氧條件下，HIF-1a誘導(dǎo)自噬在胰腺癌非干細(xì)胞去分化中的作用及

3、其確切機(jī)制；
　　(2)明確低氧條件下，HIF-1a誘導(dǎo)自噬在胰腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用及其確切機(jī)制；
　　(3)篩選能與HIF-1a特異性配對(duì)結(jié)合的DNA寡核苷酸短鏈，合成多功能納米粒子，初步探討其應(yīng)用于胰腺癌干細(xì)胞體內(nèi)外磁共振靶向成像效果。
　　研究?jī)?nèi)容和方法：
　　(1)采用改良的Transwell分離實(shí)驗(yàn)方法，篩選人胰腺癌細(xì)胞系（Panc-1）中胰腺癌干細(xì)胞以及胰腺癌非干細(xì)胞；并利用流式細(xì)胞儀、成球?qū)嶒?yàn)、免

4、疫熒光、Western Blot及體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分選出的胰腺癌細(xì)胞的干性；
　　(2)將分選出的胰腺癌非干細(xì)胞培養(yǎng)在間歇性低氧條件下（1%氧氣、94%氮?dú)猸h(huán)境中培養(yǎng)12 h后，再在20%氧氣培養(yǎng)12 h，如此反復(fù)4次），利用干擾和沉默技術(shù)，給予以下分組：
　　①對(duì)照組；
　?、谝认侔┓歉杉?xì)胞+HIF-1a siRNA；
　?、垡认侔┓歉杉?xì)胞+3-MA（自噬抑制劑）；
　?、芤认侔┓歉杉?xì)胞+HIF-1a s

5、iRNA+3-MA。在以下時(shí)間點(diǎn)（24h，48h，72h），采用顯微鏡觀(guān)測(cè)細(xì)胞成球能力及形態(tài)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CD133+細(xì)胞比例，RT-PCR及Western-blot分析細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平變化（Oct-4、c-MYC、CD44、HIF-1a、LC3-I、LC3-II、Beclin1）。
　　(3)將分選的胰腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)在間歇性低氧條件下（1%氧氣、94%氮?dú)猸h(huán)境中培養(yǎng)12 h后，再在20%氧氣培養(yǎng)12 h，如此

6、反復(fù)4次），利用干擾和沉默技術(shù)，給予以下分組：
　?、賹?duì)照組；
　?、谝认侔└杉?xì)胞+HIF-1a siRNA；
　?、垡认侔└杉?xì)胞+3-MA（自噬抑制劑）；
　?、芤认侔└杉?xì)胞+HIF-1a siRNA+3-MA。作用不同時(shí)間（24h，48h，72h）點(diǎn)，觀(guān)察以下指標(biāo)：Tranwell觀(guān)察細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況；Western-blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)含量變化（HIF-1a、CD133、CD44、E-Ca、Veme

7、ntin、MMP-9、LC3-II、Beclin1）。
　　(4)γ-Fe3O4@DMSA-DNA寡核苷酸短鏈納米顆粒合成和制備；分析其穩(wěn)定性及毒性。
　　(5)胰腺癌干細(xì)胞、胰腺癌非干細(xì)胞與γ-Fe3O4@DMSA-DNA寡核苷酸短鏈納米顆粒共浴，MTT及流式技術(shù)檢測(cè)納米粒子對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響；普魯士藍(lán)染色及3.0T磁共振觀(guān)察納米粒子與胰腺癌干細(xì)胞、胰腺癌非干細(xì)胞結(jié)合的特異性及體外成像靶向性。
　　(6)構(gòu)建

8、胰腺癌裸鼠皮下瘤模型，尾靜脈注射γ-Fe3O4@DMSA及γ-Fe3O4@DMSA- DNA納米顆粒，注射后30min、1.5h、2h、24h等不同時(shí)間點(diǎn)，采用3.0T磁共振觀(guān)察瘤體信號(hào)改變，測(cè)量T2弛豫時(shí)間。
　　研究結(jié)果：
　　(1)改良的Transwell分離實(shí)驗(yàn)可以作為分選腫瘤干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)手段之一，且該方法具有簡(jiǎn)單易行、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)。
　　(2)間歇性缺氧條件下，HIF-1a可以通過(guò)誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)胰腺癌

9、非干細(xì)胞去分化而獲得干細(xì)胞的表型和功能。
　　(3)作為缺氧誘導(dǎo)的核心分子之一，HIF-1a在缺氧應(yīng)激條件下是促進(jìn)胰腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控分子，而其主要通過(guò)誘導(dǎo)胰腺癌干細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化及自噬來(lái)實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程。
　　(4)與HIF配對(duì)的DNA寡核苷酸短鏈偶聯(lián)氧化鐵納米磁粒子可以特異性結(jié)合到胰腺癌干細(xì)胞，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合效率逐漸增高。胰腺癌非干細(xì)胞可以結(jié)合少量的DNA寡核苷酸短鏈偶聯(lián)氧化鐵納米磁粒子，但即使共育時(shí)間延長(zhǎng)，結(jié)

10、合效率也無(wú)明顯增高。同時(shí)胰腺癌干細(xì)胞結(jié)合納米磁粒子的時(shí)間明顯要早于胰腺癌非干細(xì)胞，這一時(shí)間梯度差，為臨床MRI檢測(cè)胰腺癌干細(xì)胞增加了可行性。
　　(5)裸鼠皮下胰腺癌模型中，能特異結(jié)合HIF-1a的DNA寡核苷酸短鏈偶聯(lián)氧化鐵納米磁粒子能在瘤體內(nèi)聚集，其與單純氧化鐵納米粒子在注射30min、1.5h、2h及24h后瘤體的T2弛豫時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　(1)在缺氧應(yīng)激條件下，HIF-1a通過(guò)自噬維持胰腺癌干