棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液中活性肽分離純化、分子克隆以及結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、兩棲類是一類具有生態(tài)、科研、經(jīng)濟(jì)、以及文化價(jià)值的自然資源。同時(shí)，兩棲類皮膚也是具有很大開(kāi)發(fā)潛力的生物資源寶庫(kù)。兩棲類的皮膚中含有種類繁多、功能復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)可用來(lái)抵御有害環(huán)境因子的侵襲。存在于兩棲類皮膚分泌液中的生物活性成分引起了世界上研究人員極大的關(guān)注。迄今為止，已分離鑒定出許多具有各種生物活性的蛋白以及多肽。中國(guó)擁有豐富的兩棲類資源，在284個(gè)種(亞種)中2/3是特有種，在生物活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)方面具有極大的潛力。我們收

2、集了三種兩棲類動(dòng)物：棕點(diǎn)湍蛙(Amolops loloensis)、無(wú)指盤(pán)臭蛙(Ranagrahami)以及中國(guó)林蛙(Rana chensinensis)，并對(duì)這三種兩棲類的皮膚分泌液進(jìn)行了一系列的生物活性篩選：1.胰蛋白酶水解活性檢測(cè)；2.胰蛋白酶抑制劑活性檢測(cè)；3.抗菌活性檢測(cè)；4.溶血、出血及血漿凝固活性檢測(cè)；5.血小板聚集活性檢測(cè)；6.血小板聚集抑制活性檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.三種兩棲類的皮膚分泌液都不具有胰蛋白酶水解活性；2.棕點(diǎn)

3、湍蛙以及無(wú)指盤(pán)臭蛙皮膚分泌液具有較強(qiáng)的胰蛋白酶抑制劑活性；3.棕點(diǎn)湍蛙以及無(wú)指盤(pán)臭蛙皮膚分泌液具有較強(qiáng)的抗菌活性；4.三種兩棲類的皮膚分泌液不具備出血活性，但是顯示較弱的溶血活性以及抗血漿凝固活性。5.三種兩棲類的皮膚分泌液都不具有促進(jìn)血小板聚集活性；6.棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液具有抑制血小板聚集活性。以來(lái)源于單個(gè)棕點(diǎn)湍蛙(Amolops loloensis)個(gè)體皮膚中提取的mRNA為材料，我們建立了棕點(diǎn)湍蛙皮膚cDNA文庫(kù)，得到大約為1×1

4、0<'6>個(gè)獨(dú)立的克隆。通過(guò)生物化學(xué)，分子生物學(xué)手段和研究方法，在棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液中得到一系列的皮膚活性多肽以及cDNA序列，其中包括抗茵肽，緩激肽，胸腺肽等，并對(duì)其結(jié)構(gòu)，功能進(jìn)行了相應(yīng)的研究。通過(guò)兩步分離純化過(guò)程：Sephadex G-50凝膠過(guò)濾和反相高壓液相層析(RP-HPLC)，我們從棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌物中分離純化得到3個(gè)、2類別的抗菌肽，并命名為amolopin-1a，1b和1c。借助于質(zhì)譜，我們得到這三個(gè)抗茵肽的分子量分別為

5、2665.3、2663.7和1626.0道爾頓。這兩類抗菌肽都含有多個(gè)堿性氨基酸而帶有正電荷，這是首次從湍蛙屬中分離純化得到的抗菌肽，進(jìn)一步豐富了兩棲類抗茵肽類群。我們所得到的3個(gè)抗菌肽，其中2個(gè)由24個(gè)氨基酸殘基組成，具有半胱氨酸組成的二硫鍵，形成Rana box。通過(guò)Genbank進(jìn)行blast，發(fā)現(xiàn)該類抗菌肽與來(lái)源于Rana esculenta的brevinin-1E具有87％和79％的同源性。另外一個(gè)抗菌肽由16個(gè)氨基酸殘基組成

6、，不含有半胱氨酸組成的二硫鍵，可以形成a-螺旋。這類抗茵肽和來(lái)源于Rana temporaria的Temporin-F具有50％的同源性。根據(jù)一系列的活性檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)兩類amolopin抗菌肽在一些活性上具有很大的差異。amolopin-1b具有很強(qiáng)的溶血活性和較弱的肥大細(xì)胞脫粒肽活性，而amolopin-2a則相反，但是兩者都有較強(qiáng)的促進(jìn)肥大細(xì)胞中組胺釋放的活性。amolopin-1b和2a都具有一定的抗腫瘤活性。根據(jù)編碼Rana

7、esculenta中brevinin-1E前體保守的5’端核苷酸區(qū)域設(shè)計(jì)引物，在棕點(diǎn)湍蛙皮膚cDNA文庫(kù)中篩選編碼amolopin抗茵肽的cDNA序列的單克隆。對(duì)所得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，我們篩選到編碼不同amolpin抗菌肽前體的不同的cDNA序列14條，這14條cDNA序列最終編碼3類、8條不同的amolopin抗菌肽。我們將這三類抗菌肽命名為amolopin-1，2，3系列。通過(guò)兩步分離純化過(guò)程：Sephadex G-50凝膠過(guò)濾

8、和反相高壓液相層析(RP-HPLC)，從棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌物中分離純化得到一種具有12個(gè)氨基酸的緩激肽，我們將該緩激肽命名為amolopkinin。該緩激肽和來(lái)源于Rana rugosa的ranakinin R具有76％的同源性，具有增強(qiáng)小鼠回腸肌收縮的作用。amolopkinin在N端部分具有插入片段APV，這是首次從湍蛙屬得到的緩激肽以及cDNA序列。 通過(guò)隨機(jī)篩選棕點(diǎn)湍蛙cDNA文庫(kù)，我們得到了棕點(diǎn)湍蛙胸腺肽-β<,4>的c