β-catenin介導GLP-1受體激動劑改善高果糖誘導的肝臟脂質(zhì)沉積的研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcohol fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的代謝應激性肝臟損傷，其病理學改變與酒精性肝病相似，但患者無過量飲酒史，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關肝硬化和肝細胞癌。流行病學資料證實，非酒精性脂肪性肝病已成為2l世紀全球重要的公共健康問題之一，但目前仍無特效治療，有待于針對其發(fā)生發(fā)展機制的新藥物的開發(fā)。
　　近年，果

2、糖在西方國家人群的攝入逐年增加；而在我國，隨著西方化飲食習慣對國民的影響，可樂、果汁等的消耗量明顯增加。NAFLD的發(fā)生與不良的飲食習慣，尤其是果糖的大量攝取有關。應用高果糖飲食建立肝臟脂質(zhì)沉積動物模型來觀察藥物對其影響具有一定現(xiàn)實意義。在我們課題組的前期研究中，高果糖喂養(yǎng)可使嚙齒類動物出現(xiàn)肝臟脂質(zhì)沉積，成功誘導出大鼠及小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積模型，并發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)源性甘油三酯生成增多是高果糖致肝臟脂質(zhì)沉積的主要機制。因此，本研究選取的模型為高果糖

3、誘導的肝臟脂質(zhì)沉積模型。
　　抑胃多肽（gastric inhibitory polypeptide，GIP）和胰高血糖素樣肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）是腸促胰島素兩種主要活性多肽。目前基于 GLP-1的兩類藥物包括 GLP-1受體激動劑和二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidylpeptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ）抑制劑，逐漸研發(fā)上市作為新型降糖藥物日益被關注。人們發(fā)現(xiàn) GLP-1受體在人體內(nèi)分布

4、廣泛，GLP-1在人體內(nèi)的生物學作用非常廣泛。2010年 Gupta等首次證明了人類原代肝細胞上存在GLP-1受體，使研究GLP-1與肝臟的作用具有了生物學基礎。之后陸續(xù)有臨床、動物及細胞研究發(fā)現(xiàn) GLP-1能改善肝臟脂質(zhì)沉積，但具體機制尚不明確。
　　β-catenin的功能主要為介導細胞間黏附和參與基因的表達。作為wnt信號途徑的核心分子β-catenin越來越受到人們的關注，近年來發(fā)現(xiàn)該通路與肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病

5、以及代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展也密切相關。動物實驗表明敲除β-catenin基因的小鼠肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)沉積。而且隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)β-catenin對GLP-1的生成和功能發(fā)揮起著重要作用。但目前尚無GLP-1與β-catenin在非酒精性脂肪肝發(fā)生發(fā)展中相互關系的研究。是否GLP-1通過β-catenin改善高果糖誘導的肝脂質(zhì)沉積國內(nèi)外尚無報道。因此，本項研究擬通過高果糖誘導 Wistar大鼠肝臟脂質(zhì)沉積并給予GLP-1干預治療，觀察脂質(zhì)從

6、頭合成通路及β-catenin表達的變化，并在細胞水平應用轉(zhuǎn)染技術靶向干預β-catenin表達，探討GLP-1是否通過β-catenin改善高果糖誘導的肝脂質(zhì)沉積，揭示GLP-1與β-catenin在非酒精性脂肪肝發(fā)生發(fā)展中的作用，探討 GLP-1在肝臟脂代謝中新的生物學作用及其機制，為尋找非酒精性脂肪肝新的藥物治療提供理論基礎。
　　第一部分 GLP-1受體激動劑對高果糖誘導的大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響
　　目的：應用高果糖

7、飲食誘導大鼠肝臟脂質(zhì)沉積，然后給予GLP-1干預，觀察對該模型的一般生理、生化指標以及組織病理學的影響，從而探討其對高果糖誘導的大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響。
　　方法：6周齡Wistar大鼠36只適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為2組：對照組（normal diet，ND）14只，高果糖組（high fructose diet，HFD）22只，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，熱量組成：碳水化合物65.5％，脂肪10.3%，蛋白質(zhì)24.2%，總熱量為34

8、8kcal/100g。高果糖組給予高果糖飼料喂養(yǎng)，即普通飼料中部分碳水化合物由食品級結(jié)晶果糖替代，熱量組成：碳水化合物65.5%（其中果糖供能占60%），脂肪10.3%，蛋白質(zhì)24.2%，總熱量為348kcal/100g。各組大鼠每日等熱量投喂飼料，每日記錄進食量，每周測量空腹體重。8周后，從對照組及高果糖組隨機抽取6只大鼠，3％戊巴比妥鈉麻醉后處死，留取肝臟組織，送光鏡標本，證實肝臟脂質(zhì)沉積動物模型成立。然后將高果糖組隨機分為2組：高

9、果糖飲食組（HFD）8只、艾塞那肽組（high fructose diet group with Exenatid intervention，HFD+Ex）8只。艾塞那肽組給予艾塞那肽注射液10μg／kg腹部皮下注射，每日兩次，對照組和高果糖組給予等體積生理鹽水皮下注射。藥物干預4周，每周根據(jù)新測體重值重新計算給藥量。分別于高果糖喂養(yǎng)8周和藥物干預4周末行腹腔注射葡萄糖耐量試驗（intraperitoneal glucose toler

10、ance test，IPGTT）檢測各時間點血糖值和葡萄糖曲線下面積（area under the curve, AUCglu）及清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗檢測葡萄糖輸注率（ glucose infusion rate，GIR），采集血清標本檢測空腹血糖（fasting blood glucose， FBG）、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(

11、alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)。ELISA法檢測血清空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）和游離脂肪酸（free fat acid，F(xiàn)FA）水平。采集肝臟組織標本做肝臟甘油三酯含量檢測并做肝臟組織油紅O染色觀察大鼠肝臟脂質(zhì)沉積。
　　結(jié)果：
　　1高果糖飲食誘導肝臟脂質(zhì)沉積模型建立
　　1）

12、兩組大鼠一般指標比較：與 ND組比較，HFD組大鼠體重、肝指數(shù)、FBG、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、血清 TG、FFA、肝臟TG均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05)，兩組大鼠血清TC、ALT、AST無統(tǒng)計學差異（P>0.05)。
　　2）兩組大鼠糖耐量結(jié)果比較：IPGTT結(jié)果示：HFD組0 min、5 min、30 min、60 min血糖均較ND組升高（P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。HFD組

13、AUCglu也顯著升高（P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　3）兩組大鼠葡萄糖輸注率比較：與ND組相比，HFD組GIR明顯降低（P<0.05）。
　　4）兩組大鼠肝臟組織形態(tài)學比較：肝臟油紅 O染色可見 ND組大鼠肝胞漿呈淡藍色，未見紅色脂滴；HFD組大鼠肝細胞內(nèi)可見大量紅色脂滴，提示肝細胞脂質(zhì)沉積。
　　2藥物干預后，各項指標變化
　　1）三組大鼠一般指標比較：HFD組大鼠體重、肝指數(shù)、FBG、FINS、A

14、LT、TG、FFA以及肝臟TG均明顯高于ND組(P<0.05)，艾塞那肽干預后HFD+Ex組較HFD組明顯降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。三組TC、AST無統(tǒng)計學差異（P>0.05)。
　　2）三組大鼠糖耐量結(jié)果比較：IPGTT結(jié)果示：HFD組0 min、5 min、30 min、60 min、120 min血糖均較ND組升高（P<0.05)，艾塞那肽干預后HFD+Ex組0 min、30 min、60 min、120 mi

15、n血糖較HFD組下降（P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。HFD組大鼠AUCglu高于ND組（P<0.05），經(jīng)艾塞那肽治療后HFD+Ex組AUCglu較HFD組顯著降低（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。
　　3）三組大鼠葡萄糖輸注率比較：HFD組 GIR較 ND組明顯降低（P<0.05），艾塞那肽干預后HFD+Ex組GIR較HFD組升高（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義。
　　4）三組大鼠肝臟組織形態(tài)學比較：肝臟油紅

16、O染色可見 ND組大鼠肝胞漿呈淡藍色，未見紅色脂滴；HFD組大鼠肝細胞內(nèi)可見大量紅色脂滴，經(jīng)艾塞那肽治療后HFD+Ex組紅色脂滴減少。
　　結(jié)論：
　　1高果糖飲食可以誘導大鼠肝臟脂質(zhì)沉積，并出現(xiàn)高脂血癥、胰島素抵抗。
　　2 GLP-1受體激動劑可以改善高果糖飲食引起的肝臟脂質(zhì)沉積，并可以降低體重和血脂，改善糖耐量和胰島素抵抗。
　　第二部分 GLP-1受體激動劑對肝脂代謝通路中脂質(zhì)從頭合成途徑的影響
　

17、　目的：通過檢測GLP-1受體激動劑對于脂質(zhì)從頭合成途徑中關鍵酶：乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、硬脂酰CoA脫飽和酶-1（stearoyl-CoA desaturase-1， SCD-1）以及上游轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(Sterol Regulatory Element Binding Protein-1，SREBP-1

18、)的基因和蛋白表達的影響，從脂代謝通路的角度探討GLP-1受體激動劑改善高果糖誘導的肝臟脂沉積的直接作用及其分子機制。
　　方法：動物分組及標本采集同第一部分。采用實時熒光定量PCR技術檢測ACC、FAS、SCD-1以及SREBP-1的mRNA水平，采用Western blot技術檢測ACC、FAS、SCD-1以及SREBP-1的蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1三組大鼠脂質(zhì)合成關鍵酶ACC、FAS和SCD-1的表達。與N

19、D組相比，HFD組大鼠肝臟組織中ACC、FAS和SCD-1的mRNA及蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；與HFD組相比，艾塞那肽干預后HFD+Ex組ACC、FAS和SCD-1的mRNA和蛋白表達減低（P<0.05)。
　　2三組大鼠脂質(zhì)合成上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1的表達。與ND組相比，HFD組大鼠肝臟組織中SREBP-1的mRNA和蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；與HFD組相比，艾塞那肽干預后H

20、FD+Ex組SREBP-1的mRNA和蛋白表達減低（P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1高果糖飲食可誘導大鼠肝臟脂質(zhì)從頭合成途徑的關鍵酶ACC、FAS和SCD-1及其上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1的基因和蛋白表達，表明高果糖飲食可以促進脂質(zhì)從頭合成。
　　2 GLP-1受體激動劑能降低脂質(zhì)從頭合成途徑中關鍵酶ACC、FAS和SCD-1及其上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1的基因和蛋白表達，提示GLP-1受體激動劑可能通過抑制脂質(zhì)從

21、頭合成改善肝臟脂質(zhì)沉積。
　　第三部分 GLP-1受體激動劑對β-catenin基因和蛋白表達的影響
　　目的：通過檢測GLP-1受體激動劑干預后β-catenin基因及蛋白表達的變化以及免疫組化觀測其核轉(zhuǎn)位，首先明確是否β-catenin作為下游靶點參與了GLP-1受體激動劑改善脂質(zhì)沉積的過程。
　　方法：動物分組及標本采集同第一部分。采用實時熒光定量PCR技術檢測β-catenin的mRNA表達，采用Western

22、 blot技術檢測β-catenin以及細胞核內(nèi)β-catenin的蛋白表達。免疫組化觀察β-catenin核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果：
　　1三組大鼠β-catenin的mRNA表達比較：與ND組相比，HFD組大鼠肝臟組織中β-catenin的mRNA表達減低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；與HFD組相比，艾塞那肽干預后HFD+Ex組β-catenin的mRNA表達升高（P<0.05)。
　　2三組大鼠β-catenin

23、的蛋白表達比較：與ND組相比，HFD組大鼠肝臟組織中β-catenin的蛋白表達減低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；與HFD組相比，艾塞那肽干預后 HFD+Ex組β-catenin的蛋白表達升高（P<0.05)。
　　3三組大鼠細胞核內(nèi)β-catenin的蛋白表達比較：與ND組相比，HFD組大鼠肝臟組織中細胞核內(nèi)β-catenin的蛋白表達減低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；與 HFD組相比，艾塞那肽干預后 HFD+Ex組

24、細胞核內(nèi)β-catenin的蛋白表達升高（P<0.05)。
　　4三組大鼠β-catenin的免疫組化：與HFD組相比，艾塞那肽干預后HFD+Ex組核內(nèi)β-catenin著色增多，提示肝細胞中的β-catenin核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論：
　　1高果糖飲食誘導肝臟脂質(zhì)沉積伴隨肝臟β-catenin的基因和蛋白表達減低以及細胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達減低。
　　2 GLP-1受體激動劑可以上調(diào)β-catenin的基

25、因和蛋白表達以及細胞核內(nèi)β-catenin的蛋白表達。可能GLP-1受體激動劑誘導了β-catenin的表達及核轉(zhuǎn)位。
　　3 GLP-1受體激動劑可能通過激活β-catenin改善肝臟脂質(zhì)沉積。
　　第四部分通過調(diào)節(jié)β-catenin的表達探討GLP-1受體激動劑改善高果糖誘導的肝細胞脂質(zhì)沉積的作用機制
　　目的：應用轉(zhuǎn)染技術靶向干預β-catenin的表達，觀察HepG2細胞脂質(zhì)沉積和脂質(zhì)從頭合成通路的變化，探討G

26、LP-1受體激動劑是否通過β-catenin調(diào)控脂質(zhì)從頭合成通路改善脂質(zhì)沉積，揭示GLP-1與β-catenin在脂質(zhì)合成過程中內(nèi)在關系。
　　方法：
　　1在果糖聯(lián)合Exendin-4培養(yǎng)的HepG2細胞中轉(zhuǎn)染針對β-catenin小干擾RNA，分為以下五組：正常對照組（Con），高果糖組（HF），高果糖+Exendin-4組（ HF+Ex4），高果糖+Exendin-4+對照 RNA組（ HF+Ex4+Si-contro

27、l），高果糖+Exendin-4+針對β-catenin小干擾RNA組（HF+Ex4+Si-β-catenin）。測定HepG2細胞內(nèi)TG水平和油紅O染色觀察細胞脂質(zhì)沉積情況；最后應用實時熒光定量PCR技術檢測β-catenin的mRNA表達以及脂質(zhì)從頭合成的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1和下游關鍵酶ACC、FAS、 SCD-1的mRNA表達，采用Western blot技術檢測總β-catenin、細胞核內(nèi)β-catenin的蛋白表達，以

28、及脂質(zhì)從頭合成的上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1和下游關鍵酶ACC、FAS、 SCD-1的蛋白表達。
　　2在果糖聯(lián)合Exendin-4培養(yǎng)的HepG2細胞中轉(zhuǎn)染過表達β-catenin質(zhì)粒，分為以下五組：正常對照組（Con），高果糖組（HF），高果糖+Exendin-4組（HF+Ex4），高果糖+Exendin-4+對照空質(zhì)粒組（HF+Ex4+pEGFP-N1），高果糖+Exendin-4+過表達β-catenin質(zhì)粒組（HF+Ex4

29、+pEGFP-N1-hCTNNB1）。所測指標同前。
　　結(jié)果：
　　1 HepG2細胞的脂質(zhì)沉積體外模型建立
　　HepG2細胞培養(yǎng)24小時后HF組TG含量較Con組增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），油紅O染色HF組紅染部分較Con組增多，顏色加深，表明高果糖誘導脂質(zhì)沉積體外細胞模型成功建立。
　　2靶向干預β-catenin對HepG2細胞β-catenin表達的影響
　　1）在果糖聯(lián)合 Exen

30、din-4培養(yǎng)的 HepG2細胞中轉(zhuǎn)染針對β-catenin小干擾RNA后，HF+Ex4+Si-β-catenin組β-catenin的mRNA和蛋白表達比HF+Ex4組明顯降低（P<0.05），而且核內(nèi)β-catenin蛋白表達也有減低（ P<0.05）。HF+ Ex4+Si-control組與 HF+ Ex4組比較無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　2）在果糖聯(lián)合 Exendin-4培養(yǎng)的HepG2細胞中轉(zhuǎn)染過表達β-cate

31、nin質(zhì)粒后HF+Ex4+pEGFP-N1-hCTNNB1組β-catenin的mRNA和蛋白表達比HF+ Ex4組明顯升高（P<0.05），而且核內(nèi)β-catenin蛋白表達也有增加（P<0.05）。HF+Ex4+pEGFP-N1組與 HF+Ex4組比較無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　3）在上調(diào)和下調(diào)研究中都可以發(fā)現(xiàn) HF組比 Con組β-catenin的mRNA和蛋白表達以及核內(nèi)β-catenin蛋白表達降低（ P<0.0

32、5），加用Exendin-4后HF+Ex4組β-catenin的mRNA和蛋白表達以及核內(nèi)β-catenin蛋白表達較HF組有所升高（P<0.05）。
　　3靶向干預β-catenin對HepG2細胞脂質(zhì)沉積的影響
　　1）在上調(diào)和下調(diào)研究中都可以發(fā)現(xiàn) HF組比 Con組 TG水平升高（P<0.05），油紅O染色紅染部分增多。加用Exendin-4后HF+Ex4組TG水平較HF組下降（P<0.05），油紅O染色紅染部分減少。

33、
　　2）在果糖聯(lián)合 Exendin-4培養(yǎng)的 HepG2細胞中成功轉(zhuǎn)染針對β-catenin小干擾RNA后，HF+Ex4+Si-β-catenin組TG水平比較HF+Ex4組明顯增高（P<0.05），油紅 O染色紅染部分增多。HF+Ex4+Si-control組比較HF+Ex4組無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　3）在果糖聯(lián)合 Exendin-4培養(yǎng)的HepG2細胞中成功轉(zhuǎn)染針對過表達β-catenin質(zhì)粒后HF+Ex4

34、+pEGFP-N1-hCTNNB1組TG水平比HF+Ex4組減低，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），油紅 O染色紅染脂滴減少。HF+Ex4+pEGFP-N1組比較HF+Ex4組TG水平無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。HF+Ex4+pEGFP-N1-hCTNNB1組TG水平比HF組明顯減低（P<0.05），油紅O染色紅染脂滴明顯減少。
　　4靶向干預β-catenin對HepG2細胞脂質(zhì)從頭合成上游轉(zhuǎn)錄因子和關鍵酶的影響
　　

35、1）在上調(diào)和下調(diào)研究中都可以發(fā)現(xiàn)與Con組相比較，HF組脂質(zhì)從頭合成上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1和三個關鍵酶ACC、FAS、SCD-1的mRNA和蛋白表達都有升高（P<0.05）。加用Exendin-4后HF+Ex4組上游轉(zhuǎn)錄因子 SREBP-1和三個關鍵酶 ACC、FAS、SCD-1的 mRNA和蛋白表達較HF組下降（P<0.05）。
　　2）在果糖聯(lián)合 Exendin-4培養(yǎng)的 HepG2細胞中成功轉(zhuǎn)染針對β-catenin小干

36、擾RNA后，HF+Ex4+Si-β-catenin組脂質(zhì)從頭合成上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1和三個關鍵酶ACC、FAS、SCD-1的mRNA和蛋白表達比較HF+Ex4組均明顯增高（P<0.05）。HF+Ex4+Si-control組與HF+Ex4組比較無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　3）在果糖聯(lián)合 Exendin-4培養(yǎng)的 HepG2細胞中成功轉(zhuǎn)染過表達β-catenin質(zhì)粒后HF+Ex4+pEGFP-N1-hCTNNB1組脂質(zhì)

37、從頭合成上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1和關鍵酶ACC、SCD-1的mRNA和蛋白表達以及FAS的mRNA表達比HF+Ex4組減低（P<0.05），F(xiàn)AS的蛋白表達比HF+Ex4組減低但無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。HF+Ex4+pEGFP-N1組與 HF+Ex4組比較無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 GLP-1受體激動劑Exendin-4可以通過調(diào)控SREBP-1表達，從而調(diào)控脂質(zhì)從頭合成關鍵酶 ACC、FAS