中藥提取庫(kù)中胰升血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動(dòng)劑的高通量篩選.pdf

1、糖尿病的發(fā)病率逐年遞增，已成為繼心腦血管疾病、癌癥之后的嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的第三大疾病。糖尿病分為胰島素依賴(lài)性糖尿病和非胰島素依賴(lài)型即2型糖尿病，其中2型糖尿病占總數(shù)的90-95％。2型糖尿病是一種胰島素抵抗伴胰島素不足，或胰島素分泌缺陷伴有或不伴有胰島素抵抗而導(dǎo)致的慢性高血糖疾病。目前，2型糖尿病藥物治療取得了一定進(jìn)步，但療效有限且很大程度上存在毒副作用。因此，篩選出見(jiàn)效快且無(wú)毒副作用的新藥是2型糖尿病治療的首要任務(wù)。高通量藥物篩選技術(shù)

2、是近年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的藥物發(fā)現(xiàn)技術(shù)，它結(jié)合自動(dòng)化操作系統(tǒng)和微量靈敏的生物反應(yīng)及檢測(cè)系統(tǒng)，利用分子或細(xì)胞水平的藥物篩選模型來(lái)評(píng)價(jià)化合物的生物活性。隨著生命科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們找到了與2型糖尿病相關(guān)的許多藥靶基因，為2型糖尿病實(shí)現(xiàn)高通量藥物篩選奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 胰升血糖素樣肽-1是一種前胰升血糖素衍生出來(lái)的多肽激素，能使正常人口服或靜脈注射葡萄糖后增加胰島素的分泌，因此也被稱(chēng)為腸促胰島素；它是一種在消化時(shí)由腸胃系統(tǒng)釋放出來(lái)的

3、物質(zhì)，能促進(jìn)葡萄糖依賴(lài)性的胰島素從胰腺的β細(xì)胞中釋放出來(lái)。此外，GLP-1通過(guò)激發(fā)其受體產(chǎn)生生理功能，能明顯刺激胰島素分泌、增加胰島素敏感性、抑制胰升血糖素水平和減慢胃的排空，對(duì)2型糖尿病和1型糖尿病均有效，而且將其用于治療不會(huì)產(chǎn)生低血糖。因此，高通量篩選其受體的小分子化合物激動(dòng)劑是2型糖尿病治療的新方向。 本實(shí)驗(yàn)建立了GLP-1受體基因質(zhì)粒和報(bào)告基因質(zhì)粒，并將它們共同轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞、SHSY5Y細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中，通過(guò)

4、對(duì)EC50的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)CHO細(xì)胞更適合作GLP-1R激動(dòng)劑的高通量篩選。在共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞后，用G418進(jìn)行篩選，利用GLP-1刺激細(xì)胞株優(yōu)化篩選條件，最后得到穩(wěn)定的篩選細(xì)胞株和陰性對(duì)照株，建立起GLP-1R高通量藥物篩選模型。篩選時(shí)，當(dāng)化合物與膜表面的GLP-1受體結(jié)合后，激活GLP-1受體對(duì)應(yīng)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，改變胞內(nèi)第二信使的表達(dá)水平，響應(yīng)元件響應(yīng)該變化，促進(jìn)報(bào)告基因的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)在細(xì)胞溶質(zhì)中報(bào)告基因的量間接評(píng)估化合物的生物活性