MYO7A基因缺陷的耳聾患者特異性iPS細(xì)胞的建立、基因修復(fù)及向毛細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、耳聾是臨床常見疾病，在耳聾人群中，由內(nèi)耳毛細(xì)胞、聽神經(jīng)及各級(jí)聽中樞不可逆損傷導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聾占重度耳聾的絕大部分。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)于感音神經(jīng)性耳聾的治療手段有助聽器和人工耳蝸植入等，但這些方法并不能從根本上解決問題。人內(nèi)耳耳蝸中只有約15000個(gè)毛細(xì)胞，外界聲音的過(guò)度刺激、化療、氨基糖苷類藥物的副作用及年齡的增長(zhǎng)都能夠?qū)е掠泄δ艿拿?xì)胞數(shù)量減少。在人體內(nèi)，毛細(xì)胞的不能再生直接導(dǎo)致聽力衰退與耳聾。而毛細(xì)胞位于封閉的內(nèi)耳環(huán)境中，加之其數(shù)量有限

2、，這成為我們研究其損傷及再生機(jī)制的障礙。
　　誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)技術(shù)的興起為臨床研究和治療耳聾提供了無(wú)限可能。這種技術(shù)能夠?qū)Χ喾N體細(xì)胞進(jìn)行重編程，并將其誘導(dǎo)為與胚胎干細(xì)胞具有相同全能性的多能性細(xì)胞，只要給予一定的分化條件，這種細(xì)胞就能在體外誘導(dǎo)分化為幾乎所有類型的細(xì)胞。這種技術(shù)直接規(guī)避了利用人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行研究的倫理問題;自體iPS細(xì)胞的產(chǎn)生也排除了免疫排斥的問題，使個(gè)體化醫(yī)療成為可能;構(gòu)建的疾病來(lái)源的iPSC成為疾病研

3、究及藥物篩選的良好模型。目前已有多種疾病來(lái)源的人體細(xì)胞被重編程為iPS細(xì)胞，但耳聾來(lái)源的iPS細(xì)胞的建立未見報(bào)道。因此，本研究中采用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)，完成了建立MYOTA突變的耳聾病人特異性iPS細(xì)胞株、向內(nèi)耳毛細(xì)胞分化及基因矯正的研究。
　　第一部分:首先，我們從正常人、MYO7A基因雜合雙突變耳聾患者及其聽力表現(xiàn)為正常但MYO7A基因單突變的父親尿液中提取了尿液細(xì)胞，并將其誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞;其次，我們對(duì)構(gòu)建的三株iPS細(xì)胞全

4、能性進(jìn)行了檢測(cè)分析。細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶染色、全能性基因表達(dá)、全能性標(biāo)志蛋白免疫熒光、擬胚體形成及分化實(shí)驗(yàn)、畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)都表明，我們構(gòu)建的三株iPS細(xì)胞均具有全能性。核型分析表明，我們構(gòu)建的iPS細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)正常，并未在誘導(dǎo)過(guò)程中受到破壞。最終結(jié)果表明，MYO7A突變的耳聾患者來(lái)源的尿液細(xì)胞與正常細(xì)胞一樣，都能被重編程為具有全能性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
　　第二部分:由于MYO7A在內(nèi)耳耳蝸中只在毛細(xì)胞中表達(dá)，為了研究這一基因的突

5、變對(duì)毛細(xì)胞功能有何影響及具體致聾機(jī)制，我們將正常人、MYO7A突變耳聾患者及其父親的特異iPS細(xì)胞向內(nèi)耳祖細(xì)胞及進(jìn)一步向內(nèi)耳毛細(xì)胞誘導(dǎo)分化。在誘導(dǎo)過(guò)程中，我們采用細(xì)胞單層貼壁法，分兩個(gè)階段進(jìn)行。向內(nèi)耳祖細(xì)胞誘導(dǎo)階段:通過(guò)添加FGF3和FGF10，使三株iPS細(xì)胞單層貼壁，誘導(dǎo)12天后，iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳神經(jīng)樣祖細(xì)胞和內(nèi)耳上皮樣祖細(xì)胞。早期內(nèi)耳標(biāo)志性基因表達(dá)檢測(cè)和蛋白免疫熒光檢測(cè)表明，三株iPS細(xì)胞成功分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞，并且各分化指

6、標(biāo)在三株細(xì)胞間沒有顯著性差異。這表明，無(wú)論是正常的還是MYO7A突變的iPS細(xì)胞，都能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞，三株細(xì)胞的分化表現(xiàn)趨向一致。向毛細(xì)胞誘導(dǎo)階段:我們將內(nèi)耳上皮樣祖細(xì)胞分離出來(lái)，添加EGF和維甲酸，貼壁誘導(dǎo)3周后，對(duì)分化的細(xì)胞進(jìn)行毛細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)檢測(cè)及毛細(xì)胞標(biāo)志性蛋白免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果表明正常人、MYO7A突變耳聾患者及其父親來(lái)源的iPS細(xì)胞都能被誘導(dǎo)為毛細(xì)胞樣細(xì)胞，且三株分化的毛細(xì)胞樣細(xì)胞都表現(xiàn)了毛細(xì)胞特有的電生理功能。

7、但是，具有MYO7A雜合雙突變的分化的毛細(xì)胞對(duì)于FM1-43具有極低的內(nèi)吞效率，電生理檢測(cè)中IK1和ICa與正常iPS細(xì)胞來(lái)源的毛細(xì)胞樣細(xì)胞相比顯著偏大，且其靜纖毛在聚攏成束中的表現(xiàn)與正常來(lái)源的毛細(xì)胞有明顯區(qū)別;利用western blot對(duì)myosin7a蛋白表達(dá)檢測(cè)表明，MYO7A突變導(dǎo)致了一個(gè)縮短了的myosin7a蛋白的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明，MYOTA的突變是通過(guò)影響靜纖毛束的功能來(lái)使毛細(xì)胞功能失常。
　　第三部分:為了研究

8、利用體外細(xì)胞株進(jìn)行基因矯正、以作為臨床應(yīng)用的可行性，我們利用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，對(duì)MYO7A雜合雙突變來(lái)源的iPS細(xì)胞的其中一個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行基因矯正。在經(jīng)過(guò)初步流式分選之后，測(cè)序分析和酶切驗(yàn)證分析表明，有7.5％±1.3％的細(xì)胞被純合矯正。之后我們對(duì)十個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR測(cè)序分析，未見有脫靶現(xiàn)象。全能性檢測(cè)結(jié)果表明，矯正后的iPS細(xì)胞株仍具有iPS特異的全能性。這表明我們將雜合雙突變中的其中一個(gè)突變位點(diǎn)矯正成功

9、。將這一矯正后的細(xì)胞株向內(nèi)耳毛細(xì)胞分化后，其在基因表達(dá)、蛋白表達(dá)等分化指標(biāo)的表現(xiàn)與正常來(lái)源的iPS細(xì)胞分化的毛細(xì)胞樣細(xì)胞表現(xiàn)一致，說(shuō)明經(jīng)過(guò)基因矯正操作后的iPS細(xì)胞仍能分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞。對(duì)這一iPS細(xì)胞株分化的毛細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，靜纖毛重新聚攏成束;Westernblot檢測(cè)表明，myosin7a蛋白條帶與正常來(lái)源的毛細(xì)胞相同;分化的毛細(xì)胞中能夠內(nèi)吞FM1-43FX的比例恢復(fù)正常水平;電生理檢測(cè)中，IK1和ICa恢復(fù)正常值