人工合成基因重組肽rLj-RGD4對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、分類號(hào)：——密級(jí)：——學(xué)校代碼：!Q!魚主學(xué)號(hào)至Q!三!!QQ!Q魚三連掌研耗大擎碩士學(xué)位論文⑨人工合成基因重組肽rLj—RGD4對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的抑制作用作者姓名：學(xué)科、專業(yè)：研究方向：導(dǎo)師姓名：時(shí)春風(fēng)細(xì)胞生物學(xué)海洋制藥王繼紅教授2016年4月J㈣燃必摘要rLjRGD4是一個(gè)人工合成基因重組肽。本課題組以前期研究的rLjRGD3為原型進(jìn)行了缺失突變體的基因設(shè)計(jì)，并且通過(guò)在表達(dá)序列增加終止密碼子，以獲得無(wú)純化標(biāo)簽的rLj—RGD

2、4肽表達(dá)。rLjRGD4的原型rLjRGD3是一個(gè)分子量為145kDa的RGD毒素蛋白，其來(lái)源于海洋生物七鰓鰻。rLjRGD3含有3個(gè)RGD序列，具有強(qiáng)效抗腫瘤功能。由于山一RGD3分子量較大，在未來(lái)的生物制藥中存在潛在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，故本課題對(duì)其進(jìn)行了蛋白縮短改造，設(shè)計(jì)出LjRGD4基因。本課題人工合成的LjRGD4基因構(gòu)建于pET23b質(zhì)粒載體，對(duì)獲得的帶有陽(yáng)性重組質(zhì)粒(pET23bRGD4)表達(dá)菌BL21進(jìn)行了終濃度為lmM的IP

3、TG重組表達(dá)。經(jīng)對(duì)表達(dá)時(shí)間和表達(dá)溫度的條件摸索，最后確認(rèn)rLjRGD4在30℃條件下誘導(dǎo)12h可溶性表達(dá)量最高。rLjRGD4為自身帶有5個(gè)組氨酸殘基，故對(duì)無(wú)純化標(biāo)簽的rLjRGD4仍可采用鎳柱進(jìn)行親和層析純化。rLjRGD4肽分子量為627kDa，含有4個(gè)RGD模體。純化蛋白經(jīng)N端測(cè)序，結(jié)果證實(shí)表達(dá)序列和理論推導(dǎo)序列一致。為了研究無(wú)純化標(biāo)簽的rLjRGD4肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，本課題采用小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16作為研究模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4、本課題針對(duì)腫瘤的增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的幾個(gè)關(guān)鍵性步驟，對(duì)rLjRGD4肽的功能進(jìn)行了測(cè)定。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)表明，rLjRGD4肽能夠劑量依賴性地抑制bFGF誘導(dǎo)的小鼠B16細(xì)胞的增殖，其作用的半抑制濃度(halfmaximalinhibitoryconcentrationIC50)為96pM。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rLj—RGD4以劑量依賴方式抑制B16細(xì)胞對(duì)纖粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的黏附。Transwell法和細(xì)胞劃痕

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，山RGD4對(duì)堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactorbFGF)誘導(dǎo)的B16細(xì)胞遷移具有抑制作用，且呈劑量依賴方式。利用Transwell和人工基質(zhì)膜Matrigel模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境進(jìn)行的細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rLjRGD4對(duì)堿性成纖維生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的B16細(xì)胞浸潤(rùn)具有抑制作用且呈劑量依賴方式：小劑量48M的rLjRGD4對(duì)B16細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制率為317％，中劑量96pM的LjRGD4對(duì)

6、B16細(xì)胞遷移的抑制率為723％，而高劑量144“M的LjRGD4對(duì)B16細(xì)胞遷移的抑制率達(dá)到100％。接下來(lái)，本課題對(duì)rLjRGD4肽能否引起B(yǎng)16細(xì)胞發(fā)生凋亡進(jìn)行了測(cè)定。采用Hochest33258染色和TUNELFITC染色結(jié)果顯示，rLjRGD4能顯著呈劑量依賴方式誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生凋亡，這表明了rLjRGD4抑制B16細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)是凋亡而不是壞死；利用鬼筆環(huán)肽一HTC染色研究了rLjRGD4對(duì)B16細(xì)胞骨架的影響。細(xì)胞骨架實(shí)

7、驗(yàn)結(jié)果表明，rLjRGD4蛋白能以劑量依賴方式破壞細(xì)胞骨架并抑制細(xì)胞偽足的形成。通過(guò)Westernblot法進(jìn)一步研究rLjRGD4作用于B16黑色素瘤細(xì)胞的機(jī)制，結(jié)果表明其能使Caspase3酶原表達(dá)并裂解成17kDa亞單位的水平增加、使B16細(xì)胞的抗凋亡基因BcL2表達(dá)下調(diào)。綜上所述，rLjRGD4能夠抑制腫瘤增長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性步驟包括增殖、黏附、遷移、浸潤(rùn)及細(xì)胞偽足的形成，并且能夠誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生凋亡。由于其rLjRGD4是分子