促紅細(xì)胞生成素對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16體內(nèi)外增殖及免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的:檢測(cè)小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16促紅細(xì)胞生成素受體(erythropoietin receptor,EPOR)的表達(dá),探討促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)對(duì)B16細(xì)胞體內(nèi)外增殖作用的影響、對(duì)達(dá)卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)、順鉑(cisplatin,DDP)抗腫瘤活性的調(diào)節(jié)作用及其與Bcl-2家族蛋白表達(dá)的關(guān)系。觀察EPO體內(nèi)外對(duì)免疫功能調(diào)節(jié)作用。以期對(duì)EPO合理用于臨床治療腫瘤相關(guān)性貧血和預(yù)后判斷提

2、供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:1采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(revers transcription PCR,RT-PCR)、免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡(laser scanning microscope,LSM)、免疫印跡(western blot)等方法檢測(cè)B16細(xì)胞EPOR mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 2采用四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測(cè)不同濃度EPO(5、10、100U/ml)及其與達(dá)卡巴嗪(1、10、50、100μ

3、g/ml)和順鉑(0.5,1,10,100μg/ml),聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)B16細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　 3采用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)不同濃度EPO(5、10、100U/ml)作用24小時(shí)后對(duì)B16細(xì)胞周期的影響。
　　 4采用western blot法檢測(cè)不同濃度EPO(5、10、100U/ml)對(duì)B16細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白表達(dá)的影響。
　　 5建立B16細(xì)胞移植瘤

4、模型,從接種細(xì)胞第5天起,分別用EPO、DTIC、DDP和EPO聯(lián)合DTIC、DDP藥物處理,鹽水處理組作為對(duì)照。觀察腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。部分小鼠于停藥后次日摘除眼球取血,分析血液中紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞壓積(Hct)和白細(xì)胞(WBC)水平。并引頸處死小鼠,剝離瘤體,分別稱量瘤重。部分小鼠用于生存期觀察。
　　 6將上述正常對(duì)照組、鹽水處理組和EPO處理組部分小鼠,藥物處理兩周后處死。觀察各組小鼠脾

5、臟指數(shù)、脾臟單個(gè)核細(xì)胞CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的分布、血清IL-2和TNF-α細(xì)胞因子的水平。
　　 7觀察不同濃度EPO(1、5、10、100U/ml)對(duì)正常小鼠脾細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的影響。
　　 結(jié)果：1 B16細(xì)胞表達(dá)EPOR mRNA和蛋白。
　　 2 EPO可明顯促進(jìn)B16細(xì)胞的增殖(P＜0.05);能有效抑制達(dá)卡巴嗪誘導(dǎo)B16細(xì)胞的凋亡(P＜0.05),但未能顯著影響順鉑誘導(dǎo)B16細(xì)胞的凋亡作

6、用(P＞0.05)。
　　 3流式細(xì)胞技術(shù)分析結(jié)果顯示,EPO可增加B16細(xì)胞S期的百分率,減少Go/G1期細(xì)胞比例(P＜0.05)。
　　 4 Western blot分析結(jié)果顯示,經(jīng)不同濃度EPO處理24小時(shí)后,B16細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達(dá)水平明顯增加(P＜0.05),Bax蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05)。
　　 5 EPO處理組小鼠的腫瘤體積和重量與鹽水處理組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞

7、0.05);DTIC處理組和DTIC聯(lián)合EPO處理組小鼠的腫瘤體積和重量與鹽水處理組相比顯著縮小(P＜0.01),但該兩組小鼠間的腫瘤體.積和重量沒(méi)用統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＞0.05);DDP處理組小鼠的腫瘤體積和重量與鹽水處理組相比顯著縮小(P＜0.05),但DDP聯(lián)合EPO處理組小鼠的腫瘤體積又明顯小于DDP處理組(P＜0.05)。應(yīng)用EPO處理組的小鼠外周血RBC、Hb和Hct水平明顯高于未應(yīng)用EPO組(P＜0.05)。EPO聯(lián)合DDP處

8、理組小鼠外周血的WBC水平與DDP處理組相比升高(P＜0.05)。
　　 6 EPO可明顯提高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)(P＜0.05);鹽水處理組及EPO處理組荷瘤小鼠脾CD4+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+T比值明顯低于正常小鼠(P＜0.05)。EPO處理組與鹽水處理組相比,CD4+T細(xì)胞百分率無(wú)差別(P＞0.05),而CD8+T細(xì)胞百分率下降(P＜0.05),致使EPO處理組小鼠CD4+/CD8+T比值升高(P＜0.05);鹽水

9、處理組及EPO處理組荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2含量明顯低于正常小鼠(P＜0.05),EPO處理組小鼠血清中IL-2水平與鹽水處理組相比增高(P＜0.05),但該兩組小鼠血清中TNF-α含量無(wú)差別(P＞0.05);
　　 7各濃度EPO對(duì)ConA活化的正常脾細(xì)胞增殖和細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-2含量無(wú)明顯影響(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：1 B16細(xì)胞表達(dá)EPOR mRNA和蛋白。
　　 2 EPO

10、可明顯促進(jìn)B16細(xì)胞增殖,這種促增殖作用可能與其影響細(xì)胞周期發(fā)展有關(guān)。EPO還可調(diào)節(jié)化療藥對(duì)B16細(xì)胞的抗腫瘤活性,這種作用與化療藥的類型有關(guān)。
　　 3 EPO對(duì)B16細(xì)胞的促增殖和調(diào)節(jié)化療藥抗腫瘤活性的作用,可能與EPO影響B(tài)cl-2家族蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　 4 EPO的應(yīng)用對(duì)黑色素瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響;但EPO能增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞對(duì)DTIC、DDP的敏感性,且該調(diào)節(jié)作用與化療藥的類型有關(guān)。