食管鱗癌TP53,HER-2,MRP-1突變及蛋白表達(dá)與臨床病理特征對(duì)預(yù)后的影響.pdf

1、目的：食管癌是世界上8大最常見的惡性腫瘤之一，癌癥死亡率為第6。我國(guó)是食管癌多發(fā)地域，食管鱗癌（ESCC）是其主要病理類型，占95％以上。目前，有關(guān)食管癌發(fā)生機(jī)制研究觀點(diǎn)漸趨一致，認(rèn)為癌癥是基因與環(huán)境交互作用的結(jié)局，涉及多基因參與、多因素影響、多階段的變異積累的演進(jìn)過程。隨著人類對(duì)腫瘤遺傳學(xué)的認(rèn)識(shí)不斷深入和第二代、第三代高通量測(cè)序新興技術(shù)發(fā)展，基因組學(xué)的研究進(jìn)入了蓬勃發(fā)展的階段。中國(guó)科研工作者獨(dú)立開展的有關(guān)ESCC基因GWAS研究，獲得

2、了豐碩的成果。腫瘤的浸潤(rùn)深度，分化級(jí)別，淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處器官有無轉(zhuǎn)移等均可影響ESCC患者的生存；化療患者出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象也是影響治療方案選擇及治療功效的主要影響因素。探討 ESCC發(fā)生、進(jìn)展、化療耐藥的相關(guān)基因研究對(duì)于早期預(yù)防，阻止進(jìn)展，解除耐藥具有重要意義。而癌基因和抑癌基因的激活必須通過其編碼產(chǎn)物或影響其他編碼產(chǎn)物的方式才能引起正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，運(yùn)用免疫組織化學(xué)（IHC）手段分析與這些易感位點(diǎn)或致病基因控制的蛋白產(chǎn)物對(duì)于探討基因

3、改變對(duì)腫瘤的影響具有非常重要意義。本研究結(jié)合ESCC組織P53，HER-2，MRP-1三種基因外顯子測(cè)序結(jié)果分析突變基因的突變類型及突變率差異，結(jié)合三種蛋白IHC結(jié)果，探討ESCC患者三種基因的蛋白表達(dá)情況和臨床病理特征對(duì)預(yù)后之間的影響，進(jìn)一步分析P53，HER-2，MRP-1表達(dá)之間是否具有關(guān)聯(lián)，判斷三種蛋白獨(dú)立或聯(lián)合表達(dá)對(duì)預(yù)后的價(jià)值。以期對(duì)ESCC發(fā)生發(fā)展的基因組水平的改變有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)；獲得高效，敏感的特異性蛋白檢測(cè)指標(biāo)，指導(dǎo)相關(guān)

4、人群實(shí)施有效的預(yù)防和干預(yù)治療及基因治療。
　　方法：⑴本研究分為外顯子測(cè)序組食管癌高發(fā)區(qū)ESCC患者116例和癌組織蛋白表達(dá)組ESCC患者728例，所有患者全部來自河南省鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室50萬食管癌與賁門癌生物樣品信息資料庫（病例信息時(shí)間跨度為1973-2015年）。從資料庫選取術(shù)后病理為食管鱗癌，病理臨床信息核查補(bǔ)充完善，728例蛋白表達(dá)分析組具有詳細(xì)IHC結(jié)果，成功隨訪的患者進(jìn)行研究。116例外顯子測(cè)序

5、組從治療醫(yī)院收集相應(yīng)患者癌組織及癌旁正常組織蠟塊，并置于-20度冰箱保存。⑵對(duì)外顯子測(cè)序分析組116例ESCC進(jìn)行石蠟組織DNA提取，獲得DNA后進(jìn)行電泳及DNA濃度測(cè)量及標(biāo)化，使符合外顯子測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)行測(cè)序。⑶使用SPSS21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用x2檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較，Spearman秩相關(guān)分析變量之間的相關(guān)性；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，進(jìn)行生存率的估計(jì)，log-rank法檢驗(yàn)生存差異；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

6、篩選食管鱗癌患者預(yù)后的影響因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。
　　結(jié)果：①檢測(cè)116例ESCC外顯子范圍內(nèi)的突變進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)166945個(gè)突變事件，其中SNP突變?yōu)橹?，?4.96%，Insertion和Deletion僅占2.29%與2.74%。3'Flank，5'Flank，RNA突變率較高，分別為15.32%，15.36%，42.81%。②TP53外顯子發(fā)生突變例數(shù)為80例，發(fā)生突變的頻率是68.6%。共發(fā)生100個(gè)突變事件

7、，包括83個(gè)SNP、9個(gè)Insertion和8個(gè)Deletion。錯(cuò)義突變發(fā)生率最高為58%，無義突變發(fā)生率次之為20%，然后是移碼插入發(fā)生率為9%。TP53基因外顯子發(fā)生SNP突變率明顯低于全外顯子組的SNP突變發(fā)生率，發(fā)生Deletion和Insertion的突變率明顯高于全外顯子組的SNP突變發(fā)生率。③HER2基因發(fā)生突變頻率為1.72%（2/116），共兩個(gè)突變事件；MRP-1基因發(fā)生突變頻率為3.45%（4/116），共10個(gè)

8、突變事件。④P53蛋白陽性表達(dá)比例44.1%（321/728）。P53蛋白表達(dá)在淋巴結(jié)未發(fā)生轉(zhuǎn)移組陽性率明顯低于淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移組；P53表達(dá)在病理分級(jí)III，IV及中陽性率明顯高于I，II級(jí)組；P53蛋白在中晚期陽性表達(dá)率是早期患者的陽性率的2倍以上。⑤HER-2蛋白陽性表達(dá)比例46.0%（280/728）。隨著在腫瘤分化較差，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，病理分級(jí)加重，臨床分期加重，HER-2在ESCC組織中的陽性表達(dá)率隨之升高。⑥M

9、RP-1蛋白陽性表達(dá)比例51.5%（375/728）。MRP-1蛋白隨著病理分級(jí)的加重陽性率依次上升，I，II，III，IV期的陽性率依次為34.4%，50.8%，52.4%，72.7%；MRP-1蛋白在早期中晚期患者的陽性率也依次升高34.4%，51.6%，72.7%；MRP-1表達(dá)的陽性率53.5%明顯高于未發(fā)生器官轉(zhuǎn)移組的陽性率48.9%。⑦P53蛋白表達(dá)陽性組生存較陰性組差?2=6.522，p=0.01，中位生存期分別為2.63

10、8，4.016，相差1.5倍；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（M0）P53蛋白表達(dá)較未發(fā)生轉(zhuǎn)移組預(yù)后差，中位生存期分別為2.732，4.197。⑧HER-2蛋白陽性組較陰性組預(yù)后差?2=8.199，p=0.004，中位生存期分別為2.732，4.170。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(N1)的HER-2表達(dá)陰性組較陽性組預(yù)后好；發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移組（M1）與未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（M0）HER-2表達(dá)陰性組均較陽性組預(yù)后好。⑨生存分析結(jié)果顯示MRP-1與腫瘤的生存之間不存在

11、相關(guān)性。⑩P53，HER-2的表達(dá)進(jìn)行組合組生存分析發(fā)現(xiàn)，P53，HER-2雙陽性表達(dá)組與單陽性組、雙陰性組相比預(yù)后最差。
　　結(jié)論：⑴116食管鱗癌患者均發(fā)生了不同程度的基因外顯子突變，共發(fā)生166945個(gè)突變事件，其中SNP突變?yōu)橹?，?4.96%。⑵TP53外顯子發(fā)生突變例數(shù)為80例，發(fā)生突變的頻率是68.6%。共發(fā)生100個(gè)突變事件，錯(cuò)義突變發(fā)生率最高為58%。⑶TP53外顯子發(fā)生SNP突變率明顯低于WES，發(fā)生Delet

12、ion和Insertion的突變率明顯高于全基因組外顯子測(cè)序。⑷顯示河南省林州等地高發(fā)區(qū)食管鱗癌HER2和MRP-1發(fā)生外顯子突變率分別為1.72%和3.45%。⑸P53蛋白過表達(dá)是影響食管鱗癌患者生存的獨(dú)立影響因素之一，陽性組生存較陰性組差，P53與食管鱗癌患者預(yù)后不良相關(guān)，且無論是否發(fā)生遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移。⑹HER-2蛋白表達(dá)是影響食管鱗癌患者生存的獨(dú)立影響因素之一，HER-2過表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后不良相關(guān)，且無論是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或