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文檔簡介
1、目的:
研究食管鱗癌(ESCC)組織中miR-17-92簇(miR-17a,miR-18a,miR-19a,miR-20a,miR-19b和miR-92a)的表達(dá)水平以及細(xì)胞和血清中miR-17-92簇成員miR-18a的表達(dá)水平,探討miR-17-92簇的表達(dá)差異與ESCC患者臨床病理特征、p53蛋白的表達(dá)狀況及預(yù)后的相關(guān)性,從而評估m(xù)iR-17-92簇成員的表達(dá)水平能否作為ESCC診斷及預(yù)后評估的miR-17-92簇成員的
2、表達(dá)水平能否作為ESCC診斷及預(yù)后評估的指標(biāo)。
方法:
1.在2008年2月和2010年10月期間收集105例行食管癌根治術(shù)后患者的手術(shù)標(biāo)本(食管癌組織和腫瘤遠(yuǎn)處大于5cm處正常食管上皮)。所有患者術(shù)前未行放化療,將收集到的樣本存放在液氮儲存中。提取總RNA后應(yīng)用poly A加尾法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法檢測105例ESCC組織及相應(yīng)癌旁正常組織的miR-17-92簇各成員的表達(dá)水平。
2.
3、應(yīng)用免疫組化法檢測上述105例病例中的96例ESCC組織中p53蛋白的表達(dá)情況。結(jié)合miR-17-92簇各成員的表達(dá)情況,分析p53蛋白的表達(dá)與miR-17-92簇各成員表達(dá)的相關(guān)性。
3.選用KYSE510、EC1、TE13、KYSE1170、Eca109、EC1及EC9706六株人食管鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株和HEEpiC食管正常上皮細(xì)胞株,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法檢測miR-17-92簇成員miR-18a的表達(dá)在各細(xì)胞株間的
4、表達(dá)水平。
4.選取2008年2月至2010年1月期間在浙江省腫瘤醫(yī)院接受食管切除術(shù)(R0或R1)的67例ESCC患者,術(shù)前和術(shù)后7天采集血清樣本。采集45位健康志愿者的血清作為對照。應(yīng)用莖環(huán)法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),特異性高的Taqman探針法檢測血清miR-17-92簇成員miR-18a的表達(dá)變化。
5.統(tǒng)計(jì)分析:以小核苷酸RNA U6(RNU6B)為內(nèi)參,我們采取2-ΔΔCT法比較目標(biāo)miRNA在食管鱗癌和正常食管組織
5、之間的表達(dá)差異。Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)來分析在食管癌組織中的miR-17-92基因簇的表達(dá)與正常食管上皮之間的相關(guān)性。采用Fisher精確概率檢驗(yàn)或x2檢驗(yàn)進(jìn)行miR-17-92基因簇的表達(dá)與臨床病理因素、p53蛋白表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析。采用Kaplan-Meier法和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行無進(jìn)展生存期和總生存期評估,以確定的miR-17-92基因簇表達(dá)的預(yù)后價(jià)值。使用Mann-Whitney檢驗(yàn)比較癌癥組和健康組血清miRNA濃
6、度及miRNA比值的差異,使用Wilcoxon檢驗(yàn)比較食管切除術(shù)前及術(shù)后7天的配對血清樣本。P<0.05表示顯著性差異。根據(jù)受試者工作特征ROC曲線和曲線下面積(AUC)評估血清miRNA濃度用于ESCC檢測的可行性。
結(jié)果:
1.MiR-17-92簇的6個(gè)成員在105例食管癌患者的癌組織中相對于正常組織均為高表達(dá)(P<0.05)。所有的患者按照目的miR-17-92簇的各成員表達(dá)的水平,被分為兩組,即高表達(dá)組和低或
7、正常表達(dá)組。其中miR-18a的高表達(dá)與分化程度呈負(fù)相關(guān)(P=0.025)。同時(shí),miR-92a的表達(dá)水平與臨床分期呈正相關(guān)(P=0.022)。而miR-19b的高表達(dá)與腫瘤大小(P=0.005),臨床分期(P=0.011)均呈正相關(guān)的。另外,miR-17a的過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.035)和臨床分期(P=0.022)呈正相關(guān)。而miR-19a的表達(dá),與脈管浸潤(P=0.038)呈正相關(guān)。而miR-18a,miR-17和miR-19
8、a均可作為不良預(yù)后的危險(xiǎn)因子。
2.在miR-17-92簇各成員中,僅miR-18a的表達(dá)與p53蛋白表達(dá)情況顯著相關(guān)。在miR-18a的高表達(dá)組中,p53蛋白高表達(dá)率為62.7%,而在miR-18a的低表達(dá)或正常表達(dá)組中,p53蛋白高表達(dá)率為37.8%。
3.MiR-18a在兩株高分化ESCC細(xì)胞株(EC9706,Eca109)中的表達(dá)較正常食管上皮細(xì)胞株HEEpiC低,在另一株高分化的食管癌細(xì)胞株KYSE510表
9、達(dá)稍增高,約1.61倍。而在三株低分化的食管癌細(xì)胞株TE13,KYSE1170,EC1中,miR-18a的表達(dá)明顯增高。
4.ESCC患者血清miR-18a的濃度顯著高于健康志愿者(P<0.05; ESCC患者 vs健康志愿者(M±SD):4.26±12.15 vs0.60±0.65 amol fmol/L)。 ROC曲線顯示兩組間差異較大,AUC為0.903,最佳臨界點(diǎn)位于1.065 fmol/L處,靈敏度和特異性分別為86
10、.6%和80.0%。血清中miR-18a表達(dá)水平與分化程度相關(guān)(P=0.044),與組織中miR-18a的表達(dá)呈正相關(guān)。10例ESCC患者血清中miR-18a升高的患者,術(shù)后7天的血清中的miR-18a表達(dá)較前下降。然而血清中miR-18a的表達(dá)與p53蛋白無關(guān)。
結(jié)論:
MiR-17-92簇各成員在ESCC患者癌組織相對于正常食管上皮組織均呈高表達(dá),另外miR-18a在食管癌細(xì)胞株和血清中均高表達(dá)。MiR-18a在
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