UBE2C與BRCA1在乳腺癌細(xì)胞株MDa-MB-231中表達(dá)及阿霉素耐藥的作用機(jī)制.pdf

1、研究背景:泛素偶聯(lián)酶2C(Ubiquitin-conjugating enzyme2C，UBE2C)是參與細(xì)胞周期進(jìn)展、有絲分裂調(diào)控以及靶向降解短壽命的蛋白質(zhì)。其具有癌基因性質(zhì)的特質(zhì)，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。近幾年有文獻(xiàn)報(bào)道抑制UBE2C的合成可以潛在性提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)于化療藥物的敏感性。提示UBE2C可能會(huì)成為乳腺癌治療的潛在的靶點(diǎn)。
　　BRCA1作為乳腺癌易感基因，在多數(shù)散發(fā)性乳腺癌中可以檢測(cè)到BRCA1表達(dá)缺失

2、。BRCA1表達(dá)缺失的乳腺癌細(xì)胞多為侵襲性較強(qiáng)，具有三陰性乳腺癌的特征。并且BRCA1突變的乳腺癌細(xì)胞更容易獲得對(duì)于阿霉素等藥物的抵抗。近幾年研究表明BRCA1與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中多個(gè)成員有相互作用的關(guān)系，并且可能參與影響腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療藥物的敏感性。但是探討UBE2C與BRCA1的相關(guān)報(bào)道甚少。因此，研究BRCA1的相關(guān)通路對(duì)于乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及指導(dǎo)乳腺癌臨床治療是很有必要的。
　　研究目的:探討UBE2C在乳腺癌各亞型中的分

3、布及其與腫瘤分級(jí)、總生存率及無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生存關(guān)系。進(jìn)一步探討在乳腺癌細(xì)胞中UBE2C與BRCA1的相互作用關(guān)系及阿霉素耐藥作用中可能存在的分子機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:(1)在癌癥基因數(shù)據(jù)庫(kù)Cancer Genome Atlas/TCGA及Breast Cancer ResTreat2013數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索UBE2C基因，分析UBE2C在乳腺癌類型中的分布及其與腫瘤分級(jí)、總生存率及無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生存關(guān)系。(

4、2)利用siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，將設(shè)計(jì)的UBE2C-siRNA1、2、3以及BRCA1-siRNA4、5、6轉(zhuǎn)染至三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中，同時(shí)Negative control轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中作為陰性對(duì)照。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)UBE2C mRNA及BRCA1 mRNA的表達(dá)水平。篩選出抑制效果最佳的siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染UBE2C-siRNA2及BRCA1-siRNA5，Nega

5、tive control到MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞，以未處理的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞作為空白對(duì)照，采用western blot檢測(cè)六組細(xì)胞中UBE2C、BRCA1的蛋白表達(dá)情況。(4)CCK-8檢測(cè)干擾BRCA1后0、0.25、0.5、1、2、5(μg/ml)各濃度的阿霉素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外增殖能力的影響。同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BRCA1-siRNA5至MDA-MB-231細(xì)胞，未處理組的MDA-MB-231

6、細(xì)胞作為陰性對(duì)照，將兩組細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有不同濃度阿霉素的培養(yǎng)基中，處理48h后檢測(cè)UBE2C的蛋白表達(dá)水平。(5)將UBE2C-siRNA2轉(zhuǎn)染至阿霉素處理48小時(shí)的MDA-MB-231細(xì)胞中，同時(shí)Negative control轉(zhuǎn)染至阿霉素處理48小時(shí)的MDA-MB-231細(xì)胞中作為陰性對(duì)照，Negative control轉(zhuǎn)染至未處理的MDA-MB-231細(xì)胞作為空白對(duì)照。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)MRP1、BCRP、P-gp

7、 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　(1)在TCGA數(shù)據(jù)中，比較正常乳腺組(n=22)與乳腺癌組(n=522)中UBE2C基因的表達(dá)情況，UBE2C在乳腺腫瘤組樣本中轉(zhuǎn)錄水平約為正常乳腺組的6倍(P＜0.0001)。在Breast Cancer Res Treat2013數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌各分級(jí)(grade1:n=29;grade2:n=136;grade3:n=35)，UBE2C與分級(jí)程度呈正相關(guān)。其分級(jí)程度越高的分組中U

8、BE2C的表達(dá)水平越高(P＜0.0001)。
　　(2)通過(guò)比較Breast Cancer Res Treat2013數(shù)據(jù)中在女性初步診斷淋巴結(jié)陰性的乳腺腫瘤中，UBE2C高表達(dá)與腫瘤早期轉(zhuǎn)移呈密切相關(guān)性(P＜0.001、HR=0.282)。高表達(dá)的UBE2C與增加的致死率呈強(qiáng)相關(guān)性(P＜0.05，HR＞2)。相對(duì)于UBE2C低表達(dá)的對(duì)照組來(lái)說(shuō)，高表達(dá)UBE2C的實(shí)驗(yàn)組其生存期明顯低于對(duì)照組。
　　(3) TCGA數(shù)據(jù)分析，

9、在正常乳腺組(n=22)與基底樣型乳腺癌組(n=98)中，UBE2C在基底樣型乳腺癌組中的轉(zhuǎn)錄水平是正常組樣本的四倍(P＜0.0001);比較乳腺癌各亞型(Normal-like:n=30;Luminal A:n=232;Luminal B:n=129;HER2陽(yáng)性:n=58;基底樣型:n=98)中UBE2C在正常乳腺上皮組中表達(dá)水平最低的，然而在基底樣型乳腺癌中表達(dá)水平是最高的(P＜0.01)。
　　(4)UBE2C-siRNA

10、1、2、3均可以抑制UBE2C mRNA的表達(dá)。BRCA1-siRNA4、5、6均可以抑制BRCA1 mRNA的表達(dá)。其中2、5號(hào)片段干擾效果最好。
　　(5)western blot檢測(cè)結(jié)果提示與空白及陰性對(duì)照組相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BRCA1-siRNA后，UBE2C表達(dá)量增加。然而下調(diào)UBE2C后，BRCA1基因表達(dá)不明顯變化。
　　(6)CCK-8法結(jié)果提示，同在阿霉素處理下，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，沉默BRCA1的M

11、DA-MB-231細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P＜0.02)。western blot結(jié)果分析在一定濃度范圍內(nèi)(0-lug/ml)阿霉素促進(jìn)UBE2C的表達(dá)。
　　(7)實(shí)時(shí)定量PCR提示與陰性對(duì)照組比，MRP1、BCRP、P-gp mRNA表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組均受到不同程度抑制。
　　結(jié)論:
　　1.UBE2C在乳腺癌組中高表達(dá)，與腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)。UBE2C在基底樣型乳腺癌表達(dá)量高于乳腺癌其他亞型，其表達(dá)高低與乳腺癌患者總生存期及無(wú)

12、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期密切相關(guān)。提示UBE2C可能是三陰性乳腺癌篩選及乳腺腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在分子標(biāo)志物。
　　2.沉默BRCA1基因可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7以及MDA-MB-231的UBE2C基因表達(dá)上調(diào)。提示BRCA1可能通過(guò)某種信號(hào)通路亦或者某種基因間接或直接地調(diào)控UBE2C轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　　3.沉默BRCA1的MDA-MB-231細(xì)胞更容易對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性。UBE2C與耐藥蛋白MRP1、BCRP、P-gp基因協(xié)同作用，促