NGF對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的作用及其抑制因子篩選.pdf

1、論文基于神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve Growth Factor,NGF)及其信號(hào)通路,首先研究了人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中NGF及其受體TrkA的表達(dá)情況,及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和存活的影響,以及NGF對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞作用的可能的信號(hào)通路;然后對(duì)作用于Ras不同位點(diǎn)的多肽適配體進(jìn)行篩選,并進(jìn)一步探索了有效多肽適配體的可能作用機(jī)制,以期得到治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。結(jié)果如下:
　　 1.運(yùn)用免疫熒光法與酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

2、(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中NGF的自分泌情況。結(jié)果顯示MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)NGF并存在自分泌現(xiàn)象。
　　 2.通過(guò)單核細(xì)胞直接細(xì)胞毒性測(cè)定方法(mono-nudear cell direct cytotoxicity assay,MTT)檢測(cè)NGF拮抗劑Ro08-2750對(duì)細(xì)胞活性的影響;通過(guò)5-溴脫氧尿核苷摻入法(5-bromodeo

3、xyuridine,BrdU)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況以及細(xì)胞周期分布的變化,運(yùn)用細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示Ro08-2750明顯抑制細(xì)胞活性,并具有劑量效應(yīng),NGF能夠拮抗這種效應(yīng);40μtM Ro08-2750可抑制細(xì)胞增殖率由25％降至10％;Ro08-2750使S期細(xì)胞顯著增加,G2/M期細(xì)胞顯著減少,促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序,凋亡細(xì)胞約占總細(xì)胞數(shù)的9％。
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4、.運(yùn)用免疫熒光與蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)NGF的高親和力受體酪氨酸蛋白激酶A(tyrosine kinase A,TrkA)在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá);通過(guò)MTT檢測(cè)TrkA拮抗劑k252a對(duì)細(xì)胞活性的影響,運(yùn)用PCR和Western blot研究信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)NGF受體TrkA,k252a可有效抑制細(xì)胞活性;Ro08-2750刺激p53長(zhǎng)時(shí)間轉(zhuǎn)錄,caspase-3及

5、p21短時(shí)間轉(zhuǎn)錄,并增強(qiáng)Bax的轉(zhuǎn)錄;Ro08-2750可以減弱MAPK與Akt磷酸化蛋白P.ERK1/2與p-Akt的表達(dá),但能增強(qiáng)p53與Bax的表達(dá)。
　　 4.采用多肽適配體技術(shù)將6種能夠特異性結(jié)合Ras蛋白不同位點(diǎn)的多肽適配體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞,MTT法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的活性,篩選出能夠有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的適配體;通過(guò)PCR及Western blot探索有效適配體抑制細(xì)胞活性的作用機(jī)制。多肽適配體pPER41R與

6、pPER105R能明顯抑制細(xì)胞活性;pPER41R與pPER105R能夠刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)錄p53,Bax及caspase-3,pPER41R能夠顯著減弱Akt1的轉(zhuǎn)錄,而pPER105R也能減弱Akt1的轉(zhuǎn)錄,但作用沒(méi)有pPER41R明顯:pPER41R與pPER105R能夠徹底抑制MAPK與Akt的磷酸化蛋白P.ERK1/2與p-Akt的表達(dá),但能增強(qiáng)p53與Bax的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果表明:乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的增殖

7、具有NGF依賴性,NGF能夠促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的生存。Ro08-2750對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行NGF剝奪后,細(xì)胞增殖受到抑制,出現(xiàn)細(xì)胞S期阻滯,G2/M期減少,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中,NGF很可能與其高親和力受體TrkA結(jié)合后,通過(guò)上調(diào)p-ERK1/2與p-Akt蛋白的表達(dá),下調(diào)p53與Bax蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖與存活。通過(guò)對(duì)結(jié)合Ras的多肽適配體的篩選,pPER41R與pPER10