紫外線誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞自噬及其拉曼光譜特性變化研究.pdf

1、背景:
　　來自太陽的紫外線輻射按其波長可分為315～400nm的紫外線A(ultravioletA，UVA)、280～315nm的紫外線B(UVB)和100～280nm的紫外線C(UVC)。太陽輻射通過地球大氣層時(shí)，其中所有的UVC和90％以上的UVB能被臭氧和水汽等吸收，UVA則較少受影響。因此到達(dá)地面的紫外線主要是UVA和少量UVB。現(xiàn)階段，隨工業(yè)發(fā)展地球臭氧層空洞面積的不斷增加，導(dǎo)致大氣對(duì)太陽輻射特別是UVB的吸收減少，使

2、地球上的人類受到的UVB輻射增加。人類皮膚覆蓋于機(jī)體的表面，是抵抗外界刺激的第一道防線，照射到皮膚的紫外線95％左右被角質(zhì)細(xì)胞所吸收。過量的UVB照射可引起皮膚出現(xiàn)紅斑、炎癥、老化甚至皮膚癌。
　　拉曼光譜(Ramanspectra)是一種散射光譜:當(dāng)單色的入射光投射到物質(zhì)中產(chǎn)生散射時(shí)，其中有一部分散射光與入射光頻率不同，稱為拉曼光譜。這一現(xiàn)象于1928年由印度物理學(xué)家拉曼首先發(fā)現(xiàn)。拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于DNA大分子構(gòu)象研究始于20世

3、紀(jì)70年代初期，根據(jù)拉曼譜線（峰）的特征和位置（拉曼頻移）來確定其所屬的DNA功能基團(tuán)或某一個(gè)分子鍵，以及判斷哪些DNA功能基團(tuán)和化學(xué)鍵發(fā)生改變而引起物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能上的損傷。本研究采用UVA和UVB照射HaCaT細(xì)胞后，提取細(xì)胞DNA進(jìn)行拉曼光譜分析，根據(jù)拉曼光譜相應(yīng)特征譜線的位置和強(qiáng)度變化情況研究UVA和UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞DNA的損傷形式，進(jìn)一步分析損傷過程中通過哪一具體的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量交換和作用。白藜蘆醇是從百合科菝葜屬植物菝

4、葜的干燥根莖中提取出來的一種天然的二苯乙烯類化合物，可以降低丙二醛(MDA)的生成量，增加超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)及過氧化氫酶(CAT)的活性，清除自由基。白藜蘆醇本身也對(duì)紫外線有較好的吸收作用，且含有的多酚結(jié)構(gòu)能與DNA通過靜電吸引和氫鍵作用。本試驗(yàn)通過拉曼光譜技術(shù)分析白藜蘆醇在UVB致HaCaT細(xì)胞DNA損傷過程中，對(duì)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。
　　細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的溶酶體依賴

5、的降解途徑，細(xì)胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等可通過自噬作用被降解，降解產(chǎn)生的氨基酸、脂肪酸等產(chǎn)物再重新利用。生長因子缺乏、大量氧自由基、DNA損傷等皆可誘導(dǎo)自噬。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)送到溶酶體的途徑，分為三種自噬途徑:1巨自噬，自噬最主要的形式，細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生雙層膜結(jié)構(gòu)形成自噬小體，隨后結(jié)合溶酶體形成自噬性囊泡，通過這一途徑降解自噬內(nèi)容物主要有線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核糖體等;2微自噬，溶酶體膜直接內(nèi)陷包裹周圍的待降解物質(zhì)，然后在水解酶的作用下進(jìn)行降

6、解;3分子伴侶介導(dǎo)自噬，與巨自噬、微自噬的最大區(qū)別是沒有膜性結(jié)構(gòu)形成，而是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有特殊基序的蛋白被分子伴侶識(shí)別后，與溶酶體膜上的特殊受體--溶酶體相關(guān)膜蛋白結(jié)合后進(jìn)入溶酶體被降解。自噬是細(xì)胞對(duì)于環(huán)境變化的有效、快速反應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞營養(yǎng)缺失時(shí)，細(xì)胞立即啟動(dòng)自噬以維持胞質(zhì)中氨基酸池的平衡，可通過合成新的蛋白質(zhì)、能量生成和促進(jìn)糖異生來避免細(xì)胞“餓死”。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在饑餓誘導(dǎo)下，三十分鐘后既可以檢測出自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ的改變，而其他

7、細(xì)胞的自噬水平的變化從開始到結(jié)束經(jīng)歷的時(shí)間各有不同，半衰期從8分鐘到幾小時(shí)。為研究HaCaT細(xì)胞受刺激后的自噬變化規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)選用人永生化上皮細(xì)胞(HaCaT)作為研究對(duì)象，以波長為305nm的UVB作為刺激，觀察照射后5h內(nèi)的自噬變化。
　　目的:
　　1、研究UVA和UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的損傷情況。
　　2、研究白藜蘆醇在UVB致HaCaT細(xì)胞DNA損傷過程中對(duì)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。
　　

8、3、研究UVB輻射對(duì)HaCaT細(xì)胞自噬影響的劑量反應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　HaCaT細(xì)胞接種于60mm×15mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿含體積分?jǐn)?shù)為10％的小牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、單位為1×105U/L青霉素、質(zhì)量濃度為100mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)貼壁培養(yǎng)。
　　2、紫外輻射
　　上海顧村光

9、電儀器廠生產(chǎn)，并經(jīng)上海市計(jì)量局檢測，其發(fā)射的紫外線波峰為305nm。培養(yǎng)皿中細(xì)胞長至80％～90％融合時(shí)棄培養(yǎng)基，用1mlPBS漂洗2遍后加入1.8mlPBS覆蓋細(xì)胞，放在距光源垂直距離為40cm位置進(jìn)行照射。
　　3、白藜蘆醇預(yù)處理HaCaT細(xì)胞于UVB照射前加入白藜蘆醇（使用終濃度0.1μmol/ml）培養(yǎng)6小時(shí)，棄去含有白藜蘆醇的培養(yǎng)基，1mlPBS漂洗2遍后照射方法同前。
　　4、細(xì)胞全基因組DNA提取
　　8

10、2.6mJ/cm2UVA和29.7mJ/cm2UVB照射細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)至照射后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0h時(shí)間點(diǎn)收獲HaCaT細(xì)胞，按照QIAamp DNA Mini Kit操作說明書步驟，分別對(duì)各組收獲的HaCaT細(xì)胞進(jìn)行全基因組DNA提取。
　　5、激光共焦拉曼光譜測量
　　采用激光共焦拉曼光譜倒置顯微鏡系統(tǒng)檢測各組HaCaT細(xì)胞全基因組DNA的拉曼光譜:測量前采用標(biāo)準(zhǔn)硅片對(duì)激光共焦拉曼光譜倒置顯微鏡

11、系統(tǒng)的波數(shù)軸和激光功率進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保每次測量時(shí)照射到樣品處的激光功率相同。實(shí)驗(yàn)時(shí)使用20倍物鏡，光柵采用6001ines/mm，共焦孔徑為500μm，采集的頻率范圍為600～2000cm-1，光譜分辨率為1cm-1，樣品掃描曝光積分時(shí)間為30s，重復(fù)10次。
　　6、吖啶橙(Acridine orange，AO)染色
　　不同劑量UVB照射HaCaT細(xì)胞后，分別在照后1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h收集細(xì)胞進(jìn)行染色

12、，具體方法是:棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用1mlPBS清洗2次，再加入3ml濃度為5μg/ml的AO染液，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)15min，PBS清洗3次后。熒光倒置顯微鏡下觀察染色。
　　7、Western blot檢測細(xì)胞蛋白
　　不同劑量的UVB照射HaCaT細(xì)胞后，分別在照后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h收集細(xì)胞，具體方法是:棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用上海搏彩生物工程公司的試劑盒提取細(xì)胞總蛋白并定量后進(jìn)行

13、SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、5％脫脂奶粉進(jìn)行封閉，然后室溫下一抗孵育2h、TBST漂洗3次，室溫二抗孵育2h、TBST漂洗3次后化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最后進(jìn)行顯影、定影。
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，以i±s描述，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析;多重比較，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett-T3法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果

14、:
　　1、經(jīng)UVA和UVB照射后DNA拉曼光譜的主要譜線輪廓未發(fā)生明顯變化;三組細(xì)胞鳥嘌呤氫鍵、磷酸基靜電斥力、腺嘌呤堿基分子內(nèi)能和腺嘌呤堿基堆積力特征譜線強(qiáng)度變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);多重比較結(jié)果中，僅UVA組與對(duì)照組鳥嘌呤氫鍵特征譜線強(qiáng)度變化差異不明顯(P＞0.05)，其余各組各指標(biāo)兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各組與照后時(shí)間呈現(xiàn)交互效應(yīng)(P＜0.05)。
　　2、經(jīng)UVB和UVB+白藜蘆醇照

15、射后DNA拉曼光譜的主要譜線輪廓未發(fā)生明顯變化;三組鳥嘌呤氫鍵、磷酸基靜電斥力、腺嘌呤堿基分子內(nèi)能和腺嘌呤堿基堆積力特征譜線強(qiáng)度變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);多重比較結(jié)果中，三組細(xì)胞鳥嘌呤氫鍵特征頻率兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，三組細(xì)胞磷酸基靜電斥力特征頻率兩兩相比僅UVB組和對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，三組細(xì)胞腺嘌呤堿基分子內(nèi)能特征頻率兩兩相比僅UVB組和UVB+白藜蘆醇差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

16、05)，三組細(xì)胞腺腺嘌呤堿基堆積力特征頻率兩兩相比僅對(duì)照組和UVB+白藜蘆醇差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各組與照后時(shí)間呈現(xiàn)交互效應(yīng)(P＜0.05)。
　　3、HaCaT細(xì)胞經(jīng)49.5rnJ/cm2劑量UVB照射后，繼續(xù)培養(yǎng)1.0h、2.0h、3.0h、4.0h、5.0h后觀察自噬，結(jié)果顯示自噬細(xì)胞比例從照后1.0h的20.15+2.10％先是增長到最高50.67±7.33％，然后下降直至照后5.0h還保持在21.39±3.7

17、5％，自噬細(xì)胞比例峰值出現(xiàn)在照后3.0h(P＜0.05)。HaCaT細(xì)胞經(jīng)0mJ/cm2(對(duì)照)、9.9mJ/cm2、29.7mJ/cm2、49.5mJ/cm2劑量UVB照射后，繼續(xù)培養(yǎng)3.0h后觀察自噬，結(jié)果顯示HaCaT細(xì)胞自噬比例隨UVB照射劑量增加而上升，從4.13±1.02％增長到65.78±6.14％(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、UVA和UVB可通過作用于鳥嘌呤氫鍵、磷酸基靜電斥力、腺嘌呤堿基分子內(nèi)能和

18、腺嘌呤堿基堆積力等分子結(jié)構(gòu)損傷HaCaT細(xì)胞DNA，UVB的損傷作用更大。
　　2、白藜蘆醇可通過保護(hù)HaCaT細(xì)胞DNA鳥嘌呤氫鍵、磷酸基靜電斥力和腺嘌呤堿基堆積力等分子結(jié)構(gòu)而減少UVB所致?lián)p傷。
　　3、HaCaT細(xì)胞經(jīng)49.5mJ/cm2劑量UVB照射并培養(yǎng)至1～5h，自噬細(xì)胞比例先上升然后下降，峰值出現(xiàn)在照后3h左右。HaCaT細(xì)胞經(jīng)9.9～,49.5mJ/cm2劑量UVB照射并培養(yǎng)至3.0h，自噬細(xì)胞比例隨照射劑量