CXC195通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路和激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控人肝癌細胞增殖及凋亡.pdf

1、目的：研究CXC195在體外誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡并抑制細胞增殖。探討PI3K-AKT-mTOR信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激共同誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。為CXC195治療肝癌提供幫助。
　　材料和方法：體外培養(yǎng)HepG2細胞株作為實驗組，對照組使用L-02細胞株?；瘜W(xué)反應(yīng)合成CXC195。聯(lián)合臺盼藍拒染法和MTT比色法檢測CXC195分別作用HepG2細胞和L-02細胞后細胞的存活情況，流式細胞術(shù)分析細胞凋亡，檢測濃度為10μM，25μM

2、，50μM，100μM，150μM，200μM的CXC195作用于 HepG2細胞和L-02細胞的平均生長存活率。用Western blotting檢測150μM CXC195作用HepG2細胞后， PI3K-AKT-mTOR信號通路PI3K、AKT、mTOR及磷酸化蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達變化。
　　結(jié)果：
　?、貱XC195抑制HepG2細胞生長：臺盼藍拒染法和MMT比色法檢測細胞存活結(jié)果顯示，加入CXC195后，人

3、肝癌細胞（HepG2）和正常肝細胞（L-02）的生長存活率均明顯降低。并且，隨著CXC195劑量從10μM逐漸增加到200μM，HepG2細胞存活率從97.3％逐漸降到42.9%，L-02細胞存活率從98.5%逐漸降到65.1%。不同劑量CXC195作用相同細胞生長存活率下降有顯著差異，相同劑量CXC195作用于兩組細胞比較，存活的肝癌細明顯少于正常肝細胞L-02。MMT比色法檢測結(jié)果表明，用150μMCXC195處理HepG2細胞12

4、、24、48、72小時，細胞存活率也明顯依次下降。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，150μM CXC195作用HepG2細胞24小時后，細胞存活于G0/G1期較多（71.62%vs45.17%，P<0.01），S期（17.53%vs41.11，P<0.01）和G2/M期（10.85%vs13.72%，P<0.05）細胞比例明顯減少。結(jié)果表明：與正常肝細胞（L-02）相比，CXC195能更多抑制肝癌細胞（HepG2）生長，CXC195對肝癌細胞生長的

5、抑制作用與藥物濃度和藥物作用時間呈正相關(guān)。并且CXC195主要作用于S期和G2/M期肝癌細胞HepG2。
　?、贑XC195誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡：AnnexinV/PI雙染色法標記后，通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，各濃度CXC195誘導(dǎo)人肝癌細胞（HepG2）凋亡率明顯高于正常肝細胞（L-02）。隨著CXC195劑量從10μM逐漸增加到150μM， HepG2細胞凋亡率從5.04%逐漸上升到35.21%，而L-02細胞凋亡率從4.03

6、%逐漸上升到19.30%。隨著CXC195劑量增加， HepG2細胞凋亡數(shù)量明顯增多，相同劑量CXC195作用于兩組細胞比較， HepG2細胞的凋亡率明顯高于對照組L-02細胞。結(jié)果表明：CXC195誘導(dǎo)肝癌細胞（HepG2）凋亡作用顯著強于正常肝細胞（L-02），且隨著藥物濃度增加，誘導(dǎo)凋亡作用逐漸增強。
　?、跜XC195對HepG2肝癌細胞PI3K-AKT-mTOR信號通路的影響：采用Western blotting分析，濃

7、度為150μΜ的CXC195作用HepG2細胞，Bcl-2/Bax比值、p-PI3K和PI3K、p-AKT和AKT及p-mTOR和mTOR的表達量均非常明顯少于未加CXC195對照組。聯(lián)合使用通路上PI3K、AKT、mTOR對應(yīng)的抑制劑 LY294002，SH-6和雷帕霉素處理5μmol/L后，細胞凋亡率超過50%，同時通路相關(guān)蛋白p-PI3K和PI3K、p-AKT和AKT及p-mTOR和mTOR的表達量較單用150uM CXC195均

8、非常明顯減少。結(jié)果表明：CXC195通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡，降低HepG2細胞增殖。
　?、懿捎肳estern blotting檢測發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過濃度為150μΜCXC195作用后， HepG2細胞中GRP78， GRP94、CHOP、p-PERK， PERK， p-eIF2α， eIF2α、ATF4、IRE1α， p-ASK， ASK， p-p38， p38， p-JNK、JN

9、K、Cleaved ATF6和ATF6表達量明顯高于對照組。說明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了CXC195誘導(dǎo)的HepG2細胞凋亡過程。
　　結(jié)論：CXC195能顯著抑制HepG2肝癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，主要針對S期和G2/M期細胞。而對正常肝細胞（L-02）抑制生長和誘導(dǎo)凋亡的作用則明顯較弱。CXC195的這一作用可能是通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路蛋白表達和激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來實現(xiàn)的。這些研究結(jié)果提示CXC195在體外對肝癌細