Klotho蛋白改善人EPCs功能、修復(fù)血管損傷的研究.pdf

1、背景和目的：
　　血管損傷性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化等易導(dǎo)致心力衰竭、肢體壞死、癱瘓等后果，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。因此，積極探討損傷血管修復(fù)的研究具有重大科學(xué)意義和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。血管壁主要由覆蓋血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞和中膜的平滑肌細(xì)胞構(gòu)成，是生理?xiàng)l件下保持血管結(jié)構(gòu)功能正常的基本成分。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后可導(dǎo)致粥樣斑塊形成、平滑肌細(xì)胞增殖，是血管損傷性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)。成熟內(nèi)皮是終末分化細(xì)胞，再生能力有限，針對(duì)原位內(nèi)皮

2、的防治策略不能有效修復(fù)損傷性血管。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類(lèi)可以分化成成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體血管發(fā)生損傷時(shí)，EPCs能夠通過(guò)遷移、黏附到損傷部位，增殖、分化成內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)損傷血管，是目前再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)與前沿。研究發(fā)現(xiàn)EPCs會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而衰老，具體表現(xiàn)在EPCs結(jié)構(gòu)退行性變、功能減退，數(shù)量減少，血管內(nèi)皮損傷后修復(fù)能力下降。Klotho蛋白(KL)蛋白是一種內(nèi)源

3、性抗衰老物質(zhì)，主要在腎小管上皮表達(dá)，有膜結(jié)合型和分泌型兩種異構(gòu)體。Klotho蛋白基因敲除的小鼠骨髓和外周血中EPCs數(shù)量顯著降低，提示Klotho蛋白作為重要抗衰老因素之一可能參與EPCs的功能調(diào)控和血管損傷修復(fù)。本研究擬探討Klotho蛋白對(duì)EPCs分化、增殖、遷移、黏附和旁分泌等細(xì)胞功能的影響;并構(gòu)建C57BL/6小鼠頸動(dòng)脈損傷模型以揭示其能否通過(guò)EPCs動(dòng)員、歸巢促進(jìn)血管損傷修復(fù)。
　　方法：
　　從健康人外周血中分

4、離并誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs，觀察細(xì)胞形態(tài)并利用其攝取DIL-ac-LDL和特異性結(jié)合UEA-1進(jìn)行鑒定。分別給予0.1、1、10nmol/L Klotho蛋白刺激，同時(shí)設(shè)置PBS空白對(duì)照組、VEGF組(10nmol/L)和Akt信號(hào)通路抑制組（同時(shí)加入10nmol/L Klotho蛋白和1∶1000的Akt抑制劑）。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度Klotho蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)各組細(xì)胞中CD34+/CD133+和CD31+/vWF+陽(yáng)性率;Transw

5、ell方法檢測(cè)各組EPCs的遷移能力;細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的黏附能力;ELISA方法檢測(cè)各組EPCs旁分泌SDF-1、bFGF、EGF等細(xì)胞因子變化;Western-blot方法檢測(cè)各組EPCs中VEGF和VEGFR-2表達(dá)變化。
　　構(gòu)建C57BL/6小鼠頸動(dòng)脈損傷模型，分別靜脈注射生理鹽水、Klotho蛋白、VEGF、Klotho蛋白+VEGF進(jìn)行干預(yù)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3d時(shí)Klotho蛋白對(duì)頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血中EPC

6、s動(dòng)員的影響;同時(shí)ELISA方法檢測(cè)Klotho蛋白對(duì)頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血中VEGF、SDF-1、EGF、bFGF表達(dá)的影響;測(cè)定Klotho蛋白處理頸動(dòng)脈損傷小鼠不同時(shí)期外周血中ET-1和NO含量的變化;利用活細(xì)胞熒光染料CM-DiI和Dio-perchlorate標(biāo)記經(jīng)Klotho蛋白誘導(dǎo)處理的EPCs并通過(guò)尾靜脈注射到頸動(dòng)脈損傷小鼠體內(nèi)，3d后取損傷段頸動(dòng)脈，暴露內(nèi)膜面激光共聚焦顯微鏡下觀察檢測(cè)各組EPCs的歸巢情況;14d時(shí)利用

7、cy5-CD31標(biāo)記歸巢EPCs分化的內(nèi)皮細(xì)胞，檢測(cè)各組頸動(dòng)脈損傷小鼠歸巢EPCs的再內(nèi)皮化情況;H&E染色檢測(cè)各組頸動(dòng)脈損傷血管內(nèi)膜增生的變化。
　　結(jié)果：
　　我們發(fā)現(xiàn)從健康人外周血單核細(xì)胞層中可分離誘導(dǎo)培養(yǎng)得到DIL-ac-LDL攝取和UEA-1結(jié)合雙陽(yáng)性的EPCs。流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)0.1、1、10nmol/L Klotho蛋白均能夠顯著增加CD34+/CD133+ EPCs和CD31+/vWF+內(nèi)皮細(xì)胞的陽(yáng)性率（vs

8、.對(duì)照組，P＜0.05）;Transwell、細(xì)胞粘附和ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度Klotho蛋白能夠顯著促進(jìn)人EPCs遷移、黏附和細(xì)胞因子SDF-1、EGF、bFGF的旁分泌能力（vs.對(duì)照組，P＜0.05）;同時(shí)Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)0.1、1、10nmol/L Klotho蛋白作用能夠促進(jìn)EPCs中VEGF和VEGFR-2的表達(dá)（vs.對(duì)照組，P＜0.05）;而10nmol/L Klotho蛋白和Akt信號(hào)通路抑制劑Ak

9、t inhibitor(1∶1000)同時(shí)作用于人EPCs時(shí)，CD34+/CD133+ EPCs和CD31+/vWF+內(nèi)皮細(xì)胞的陽(yáng)性率顯著降低，同時(shí)EPCs遷移、黏附和細(xì)胞因子SDF-1、EGF、bFGF的旁分泌能力也隨之顯著降低（vs.10nmol/L Klotho蛋白，P＜0.05）。利用導(dǎo)絲損傷建立了C57BL/6頸動(dòng)脈損傷模型后，流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白和VEGF均能顯著增加頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血EPCs數(shù)量（vs.對(duì)照組

10、，P＜0.05）;同時(shí)刺激SDF-1、bFGF、EGF、VEGF等因子的分泌（vs.對(duì)照組，P＜0.05）;增加外周血中NO分泌而降低ET-1的表達(dá)（vs.對(duì)照組，P＜0.05）;并能夠顯著增加損傷區(qū)域歸巢EPCs數(shù)量并降低損傷血管內(nèi)膜增生（vs.對(duì)照組，P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　本課題首次直接揭示Klotho蛋白可促進(jìn)人EPCs體外分化、遷移、黏附及旁分泌能力，其機(jī)制可能與促進(jìn)VEGF/VEGFR-2表達(dá)及Akt信