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文檔簡介
1、目的:
周圍神經(jīng)損傷是臨床常見的致殘性疾病,發(fā)病率呈逐年增高的趨勢。本研究以ADSCs為種子細(xì)胞的源泉,將其在多因子的聯(lián)合作用下誘導(dǎo)分化為施萬樣細(xì)胞,以ANA為支架構(gòu)建組織工程神經(jīng),橋接大鼠缺損的坐骨神經(jīng),觀察損傷神經(jīng)順向軸漿運(yùn)輸?shù)陌衅鞴佟枘c肌中運(yùn)動終板(Motor end plate,MEP)形態(tài)、數(shù)量以及乙酰膽堿酯酶(AchE)的含量;檢測逆向軸漿運(yùn)輸?shù)陌衅鞴佟顾韬图股窠?jīng)節(jié)中神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF、CNTF和NGF)及
2、JAK/STAT通路中P-JAK2/JAK2和P-STAT3/STAT3的表達(dá),應(yīng)用JAK抑制劑AG490后,再次檢測各因子的表達(dá)。從而闡明周圍神經(jīng)再生修復(fù)的分子機(jī)制,完善相關(guān)的理論,為周圍神經(jīng)損傷的臨床康復(fù)治療提供重要的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
方法:
一、ADSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
?。ㄒ唬┓蛛x、培養(yǎng)
雄性Wistar大鼠,體重100±20 g,無菌條件下切取附睪旁脂肪組織,酶法消化脂肪組織后進(jìn)行
3、ADSCs培養(yǎng),待貼壁細(xì)胞約鋪滿瓶底80%時,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
?。ǘ╄b定:選擇第4代ADSCs對其進(jìn)行鑒定
1、采用油紅O和茜素紅染色檢測ADSCs的多向分化能力。
2、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子:CD29、CD44、CD49、CD45、CD31及CD106。
二、ADSCs誘導(dǎo)分化為施萬樣細(xì)胞及施萬樣細(xì)胞的鑒定
1、取第4代ADSCs,在誘導(dǎo)因子的作用下向SC定向誘導(dǎo)分化。
4、 2、分別采用免疫熒光、Western Blotting和Real-time PCR從蛋白和基因水平檢測SC特異性標(biāo)志物GFAP、S-100和P75的表達(dá)。
3、采用MTT實驗檢測施萬樣細(xì)胞的增殖能力。
三、組織工程神經(jīng)構(gòu)建
1、雄性Wistar大鼠,體重200-250 g,10%水合氯醛麻醉大鼠,無菌條件下切取雙側(cè)坐骨神經(jīng),長約為15mm。參照劉承吉等低滲—除垢劑法制備ANA,作為組織工程神經(jīng)的支架。<
5、br> 2、應(yīng)用PKH-26熒光染料標(biāo)記ADSCs和施萬樣細(xì)胞。
3、將標(biāo)記后的ADSCs及施萬樣細(xì)胞按1×106/ml的接種密度從ANA的一端注入,置于含有相應(yīng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后備用。
四、動物分組與坐骨神經(jīng)損傷模型制備及橋接操作
1、實驗動物分組
120只雄性Wistar大鼠(體重200-250 g,購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部)隨機(jī)分為正常對照組、DMEM組(支架內(nèi)單
6、純注射細(xì)胞培養(yǎng)基)、ADSC組(支架內(nèi)注射ADSCs懸液)、SC組(支架內(nèi)注射施萬樣細(xì)胞懸液)和AG組(同SC組,指標(biāo)檢測前72 h給與AG490進(jìn)行干預(yù))。
2、手術(shù)操作
無菌條件下,各組分別用相應(yīng)的組織工程神經(jīng)橋接于大鼠損傷神經(jīng)的兩斷端處,手術(shù)顯微鏡下端-端縫合神經(jīng)外膜,抗生素沖洗創(chuàng)面,縫合肌肉及皮膚。
結(jié)果:
一、ADSCs具有干細(xì)胞的特征
倒置顯微鏡下觀察ADSCs呈多邊形、長梭
7、形,團(tuán)簇狀生長。ADSCs具有成脂和成骨分化能力,并且細(xì)胞表面分子CD29(+)、CD44(+);CD49(-)、CD45(-)、CD31(-)、CD106(-)。以上結(jié)果揭示ADSCs具有干細(xì)胞的特性。
二、ADSCs誘導(dǎo)分化為施萬樣細(xì)胞并鑒定
誘導(dǎo)初期,細(xì)胞體積減小、立體感增強(qiáng),部分細(xì)胞胞體收縮成梭形,兩側(cè)有對稱生長的細(xì)長突起。10-12 d后胞體繼續(xù)收縮呈梭形,排列成柵欄樣,可見細(xì)長的突起,且互相吻合成網(wǎng)。We
8、stern Blotting、免疫熒光和Real-time PCR結(jié)果顯示,幾乎所有分化細(xì)胞均表達(dá)GFAP、S100和p75,類似于真正的SC。
三、施萬樣細(xì)胞具有較強(qiáng)的有絲分裂增殖能力
MTT實驗顯示在誘導(dǎo)分化的第1-3 d細(xì)胞生長緩慢,3d以后細(xì)胞迅速增殖并持續(xù)到第7d,第9-11 d細(xì)胞仍處于增殖狀態(tài),但增殖速度卻有所下降。同時,倒置顯微鏡下可見施萬樣細(xì)胞的有絲分裂現(xiàn)象。
四、PKH-26熒光追蹤AD
9、SCs和施萬樣細(xì)胞
免疫熒光結(jié)果顯示術(shù)后12 W可見PKH-26標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)出紅色熒光信號,說明ADSCs和施萬樣細(xì)胞于術(shù)后12W仍存活于宿主體內(nèi)。
五、施萬樣細(xì)胞聯(lián)合州A具有明顯促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)的作用
?。ㄒ唬┥窠?jīng)電生理檢測評估坐骨神經(jīng)的功能恢復(fù)情況
術(shù)后6W,AG組和SC組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.05)。術(shù)后12W,各組間表達(dá)趨勢同術(shù)后6W,且AG組神經(jīng)
10、電生理參數(shù)改善程度要優(yōu)于其他組(P<0.05)。
?。ǘ╇婄R觀察再生神經(jīng)纖維的超微結(jié)構(gòu)
AG組和SC組再生神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于DMEM組和ADSC組,表現(xiàn)為:髓鞘結(jié)構(gòu)較規(guī)整、髓鞘較厚且厚度均一。
?。ㄈ〢chE染色觀察腓腸肌MEP形態(tài)、數(shù)量及分析AchE光密度值
光鏡下,正常對照組腓腸肌MEP AchE染色呈紅棕色,圓形或橢圓形,著色均勻。術(shù)后6W,AG組和SC組MEP形態(tài)較規(guī)整、數(shù)量以及Ac
11、hE光密度值均明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.05)。術(shù)后12W,各組間比較趨勢同術(shù)后6W,且AG組MEP數(shù)量增多,AchE光密度值明顯升高(P<0.05)。
六、施萬樣細(xì)胞結(jié)合ANA促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生修復(fù)的機(jī)制
?。ㄒ唬¦estern Blotting檢測BDNF、CNTF、NGF、JAK2、P-JAK2、STAT3和P-STAT3蛋白的表達(dá)。
1、在脊髓
(1)術(shù)后6W,AG組和SC組患側(cè)
12、脊髓內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)量明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.01),且AG組上述三蛋白表達(dá)量高于SC組(P<0.01),接近于正常對照組(P>0.05)。術(shù)后12W,各組間BDNF、CNTF和NGF蛋白表達(dá)趨勢同術(shù)后6W,表達(dá)量高于術(shù)后6W(P<0.05)。
(2)術(shù)后6W,患側(cè)脊髓內(nèi)JAK2蛋白在組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而對于P-JAK2和STAT3/P-STAT3蛋白,AG組和SC
13、組表達(dá)量明顯低于DMEM組和ADSC組(P<0.01);且AG組低于SC組(P<0.01)。術(shù)后12W,除外JAK2蛋白在AG組、SC組、DMEM組和ADSC組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); AG組STAT3蛋白的表達(dá)量明顯升高(P>0.05),其他表達(dá)趨勢同術(shù)后6W。
2、在脊神經(jīng)節(jié)
(1)術(shù)后6W,AG組和SC組患側(cè)脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)量明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.
14、01),低于正常對照組(P<0.05);且AG組上述三蛋白表達(dá)量高于SC組(P<0.01)。術(shù)后12W,除AG組BDNF蛋白表達(dá)量接近于正常對照組水平外(P>0.05);其他表達(dá)趨勢同術(shù)后6W。
(2)術(shù)后6W,AG組和SC組患側(cè)脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)JAK2和P-JAK2蛋白的表達(dá)量明顯低于DMEM組和ADSC組(P<0.05);且AG組低于SC組(P<0.05)。術(shù)后12W,JAK2蛋白表達(dá)在各組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義,P-JAK2蛋白表
15、達(dá)趨勢同術(shù)后6W。
(二)免疫熒光化學(xué)染色顯示BDNF、CNTF、NGF、P-JAK2和P-STAT3蛋白的表達(dá)。
1、在脊髓
(1)術(shù)后6W,AG組和SC組患側(cè)脊髓內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)量明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.01),且AG組接近于正常對照組(P>0.05)。術(shù)后12W,BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)趨勢同術(shù)后6W。
(2)術(shù)后6W,AG組患側(cè)脊髓內(nèi)P-J
16、AK2和P-STAT3蛋白的表達(dá)量低于DMEM組、ADSC組和SC組(P<0.05)。術(shù)后12W,除AG組P-JAK2蛋白的表達(dá)量接近于正常對照組外(P>0.05),其他差異趨勢同術(shù)后6W。
2、在脊神經(jīng)節(jié)
(1)術(shù)后6W,AG組和SC組患側(cè)脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)量明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.01),但低于正常對照組(P<0.01);且AG組表達(dá)量高于SC組(P<0.05)。術(shù)后1
17、2W,BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)趨勢同術(shù)后6W。
(2)術(shù)后6W,AG組患側(cè)脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)P-JAK2和P-STAT3蛋白的表達(dá)量低于DMEM組、ADSC組和SC組(P<0.05),但高于正常對照組(P<0.05)。術(shù)后12W,除AG組P-STAT3蛋白的表達(dá)量接近于正常對照組外(P>0.05),其他差異趨勢同術(shù)后6W。
結(jié)論:
1、ADSCs能成功誘導(dǎo)分化為施萬樣細(xì)胞,表達(dá)SC標(biāo)記物。
2
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