復(fù)合GDNF和VEGF質(zhì)粒的異體脫細(xì)胞神經(jīng)支架對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的修復(fù)作用.pdf

1、本研究擬通過(guò)化學(xué)萃取獲得脫細(xì)胞的大鼠同種異體神經(jīng)支架，復(fù)合上編碼膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glialcellline-derivedneurotrophicgrowthfactor,GDNF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建一種具有生物活性的人工神經(jīng)復(fù)合體并研究其在修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損中的作用，為探索自體神經(jīng)移植的替代方法提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、第一部分大鼠脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)支架的構(gòu)建。 目的：構(gòu)建大鼠脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)支架。 方法：健康雌性SD大鼠50只，體重在450g-500g之間作為供體。 采用Triton-X1.00和脫氧膽酸鈉通過(guò)低滲-脫細(xì)胞的組織工程學(xué)方法來(lái)處理新鮮大鼠坐骨神經(jīng)。鈷一60γ射線輻照消毒滅菌后，通過(guò)大體觀察、光鏡觀察、掃描電鏡觀察評(píng)價(jià)其組織形態(tài)。4只Wistar大鼠作為受體行體內(nèi)橋接實(shí)驗(yàn)，術(shù)后3天，4周取支架作石蠟切片，HE染色

3、；3只Wistar大鼠作為受體行背部肌肉包埋實(shí)驗(yàn)，術(shù)后1周取支架作石蠟切片，HE染色；評(píng)價(jià)細(xì)胞相容性和組織相容性。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)化學(xué)萃取后支架呈半透明狀，較新鮮神經(jīng)略有收縮。光鏡觀察、掃描電鏡觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞成分殘留，僅剩下較完整的基底膜管道。肌肉包埋實(shí)驗(yàn)后1周支架周圍有輕微的炎癥反應(yīng)，周圍肌肉無(wú)明顯壞死。體內(nèi)橋接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)術(shù)后3天雪旺細(xì)胞即可長(zhǎng)入支架，4周后空的基底膜管可被細(xì)胞充填，支架內(nèi)外無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。 第二部分

4、復(fù)合G1)NF、VEGl*質(zhì)粒的脫git胞神經(jīng)支架對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用 目的：評(píng)價(jià)用復(fù)合GDNF、VEGF質(zhì)粒的脫細(xì)胞神經(jīng)支架橋接神經(jīng)缺損時(shí)對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用。 方法：125只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，梨狀肌下切除10mm坐骨神經(jīng)制備神經(jīng)缺損模型。A組用第一部分制備的脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)，再注射101xl(5μg)pcDNA-GDNF-GFP質(zhì)粒，1Oμl質(zhì)粒包埋液，10／xl載體轉(zhuǎn)染液，20μl雙蒸水入支架

5、構(gòu)建成具有生物活性的人工神經(jīng)，即基因活化的細(xì)胞外基質(zhì)(GAM)。B組用10μl(5μg)pDsVEGFl65Redl-N1質(zhì)粒，其余同A組；C組用5μl(2．5gg)pcDNA-GDNF-GFP質(zhì)粒+5itl(2．5gg)pDsVEGFl65Redl-N1質(zhì)粒，其余同A組；D組僅用脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)；E組用自體神經(jīng)掉轉(zhuǎn)180度修復(fù)。術(shù)后3天，1周，4周，12周取支架，L4-L5脊髓，作激光共聚焦顯微鏡觀察；作脊髓組織中GDNF、VEGF

6、的RT-PCR檢查；作GDNF、VEGF、iNOS(induciblenitricoxidesynthase)免疫組化觀察；脊髓標(biāo)本再作尼氏染色，計(jì)數(shù)雙側(cè)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)目，求出神經(jīng)元的恢復(fù)率。 結(jié)果：術(shù)后3天，A、B、C組的支架和脊髓中即可見(jiàn)到相應(yīng)的熒光表達(dá)，術(shù)后l周表達(dá)最強(qiáng)，至術(shù)后12周仍有較強(qiáng)表達(dá)。免疫組化顯示術(shù)后3天，各組中即有GDNF陽(yáng)性細(xì)胞，A、C組表達(dá)最強(qiáng)，術(shù)后12周仍可檢測(cè)出；VEGF陽(yáng)性細(xì)胞在B、C組的表達(dá)最

7、強(qiáng)，術(shù)后12周也可檢測(cè)出；GDNF或VEGF陽(yáng)性細(xì)胞在支架中主要是雪旺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞和部分炎癥細(xì)胞，在脊髓中主要是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。RT-PCR分析顯示A組脊髓中GDNFmRNA的表達(dá)水平在術(shù)后3天即明顯上調(diào)，術(shù)后l周最強(qiáng)，12周仍可檢測(cè)到；B組脊髓中VEGFmRNA在在術(shù)后3天也明顯上調(diào)，術(shù)后1周最強(qiáng)，12周仍可檢測(cè)到。iNOS免疫組化結(jié)果顯示C組術(shù)后2周iNOS表達(dá)低于D組，與E組沒(méi)有顯著性差異。尼氏染色結(jié)果顯示C組神經(jīng)元的恢復(fù)率高

8、于D組，與E組沒(méi)有顯著性差異。 第三部分復(fù)合GDNF、VEGF質(zhì)粒的脫細(xì)胞神經(jīng)支架對(duì)再生軸突的作用 目的：評(píng)價(jià)用復(fù)合GDNF、VEGF質(zhì)粒的脫細(xì)胞神經(jīng)支架橋接神經(jīng)缺損時(shí)對(duì)再生軸突數(shù)量和質(zhì)量的影響。 方法：術(shù)后12周取支架、支架遠(yuǎn)近端的神經(jīng)組織，作石蠟切片，HE染色，計(jì)數(shù)遠(yuǎn)近端的再生軸突數(shù)、再生軸突相對(duì)面積。取遠(yuǎn)端的神經(jīng)組織，作超薄切片，透射電鏡觀察，計(jì)算髓鞘厚度、相對(duì)髓鞘面積、相對(duì)神經(jīng)組織面積。作墨汁灌注后計(jì)算支

9、架內(nèi)再生血管的相對(duì)面積。 結(jié)果：術(shù)后12周支架近端的再生軸突數(shù)在各組間沒(méi)有顯著性差異，但在遠(yuǎn)端，A、B、C3組間沒(méi)有顯著性差異，但高于D組，低于E組，有顯著性差異。超微結(jié)構(gòu)觀察中，C組再生髓鞘、軸突等相關(guān)指標(biāo)優(yōu)于A、B、D組，但較E組差，差異均有顯著性。術(shù)后12周B、C組支架中再生血管的指標(biāo)均優(yōu)于A、D組，但較E組差，差異均有顯著性。 第四部分復(fù)合GDNF、VIEGF質(zhì)粒的脫細(xì)胞神經(jīng)支架對(duì)再生神經(jīng)功能恢復(fù)的影響

10、目的：評(píng)價(jià)用復(fù)合GDNF、VEGF質(zhì)粒的脫細(xì)胞神經(jīng)支架橋接神經(jīng)缺損時(shí)對(duì)再生神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。 方法：術(shù)后12周通過(guò)電生理檢查了解再生神經(jīng)的傳導(dǎo)功能。取雙側(cè)腓腸肌，測(cè)量其濕重恢復(fù)率和面積恢復(fù)率，并作氯化金染色觀察運(yùn)動(dòng)終板形態(tài)。同時(shí)行步態(tài)分析，測(cè)量坐骨神經(jīng)指數(shù)。 結(jié)果：C組的電生理檢測(cè)指標(biāo)、腓腸肌濕重和面積恢復(fù)率、坐骨神經(jīng)指數(shù)均明顯優(yōu)于A、B組，但較E組差，差異有顯著性。 第五部f1．復(fù)合GI)Ⅻ、VIEGF質(zhì)粒的

11、脫細(xì)胞神經(jīng)支架在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的安全性分析 目的：評(píng)價(jià)用復(fù)合GDNF、VEGF質(zhì)粒的脫細(xì)胞神經(jīng)支架修復(fù)周圍神經(jīng)后目的基因?qū)h(yuǎn)處器官的影響。 方法：術(shù)后12周，A組，B組各3只大鼠取心，肝，腎，脾作RT-PCR檢測(cè)。另取一小塊組織，作石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。 結(jié)果：術(shù)后12周，A、B組心，肝，腎，脾組織的RT-PCR檢測(cè)均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)目的基因的表達(dá)。心，肝，腎，脾組織沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)，組織形態(tài)，結(jié)構(gòu)正常，

12、沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的癌變組織。 結(jié)論 1．低滲．脫細(xì)胞的組織工程學(xué)方法處理新鮮大鼠坐骨神經(jīng)，可以獲得脫細(xì)胞的同種異體神經(jīng)支架，具有一般神經(jīng)組織的天然孔隙和三維結(jié)構(gòu)，材料的免疫原性基本被去除，具有良好的細(xì)胞相容性和組織相容性。 2．脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)可以在體內(nèi)通過(guò)多聚賴氨酸與pcDNA3．0-GDNF-GFP和pDsVEGFl65Redl—N1真核表達(dá)質(zhì)粒復(fù)合成具有生物活性的神經(jīng)支架——GDNF-VEGF基因活化的細(xì)胞外

13、基質(zhì)。 3．術(shù)后1周GAM中的GDNF和VEGFl65質(zhì)粒DNA在創(chuàng)傷局部達(dá)到轉(zhuǎn)染高峰．并且可隨軸突逆行轉(zhuǎn)染脊髓中的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，持續(xù)表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)至少12周；轉(zhuǎn)染不僅有緩釋作用，還有特異性和時(shí)效性。 4．GDNF-VEGF-GAM可以促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)元的數(shù)量和功能，其機(jī)制可能與抑制凋亡通路有關(guān)。 5．GDNF-VEGF-GAM可以提高再生軸突的數(shù)量和功能。