癌基因Ras及其常見突變與p53協(xié)同作用對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞化療藥物敏感性的研究.pdf

1、目的：Ras是一種原癌基因，其突變廣泛存在于多種腫瘤細(xì)胞中，在結(jié)直腸癌中突變率可達(dá)30％以上，與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展以及靶向治療療效預(yù)測等均有密切關(guān)系。突變后的Ras結(jié)構(gòu)發(fā)生改變引起下游多條信號(hào)通路激活，并且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。p53基因是發(fā)現(xiàn)最早的一種腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞周期、凋亡、衰老、維持基因組穩(wěn)定性、修復(fù)損傷DNA。近年來，p53作為基因治療的靶標(biāo)已初步應(yīng)用于臨床，通過對(duì)p53基因表達(dá)水平的提升以及p53正常功能的修復(fù)參

2、與腫瘤的治療。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生過程中p53與Ras介導(dǎo)的通路之間存在著復(fù)雜的相互協(xié)同作用關(guān)系。因此，在Ras高水平突變的結(jié)直腸癌藥物治療過程中，p53與Ras基因的突變之間存在著怎樣的相互作用關(guān)系需要通過體內(nèi)、體外的科學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入的研究。本課題旨在利用體外結(jié)腸癌細(xì)胞模型，探討p53與Ras及常見突變協(xié)同作用對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑藥物敏感性的影響。為在Ras高突變率的情況下，研究提高化療藥物療效以及開發(fā)新的輔助治療手段提供可靠的實(shí)驗(yàn)依

3、據(jù)。
　　方法：第一部分：收集67對(duì)結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁組織，提取mRNA，RT-PCR擴(kuò)增K-Ras和p53序列，檢測K-Ras和p53突變情況；應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析癌組織和癌旁組織突變的差異，應(yīng)用秩相關(guān)性分析K-Ras突變與p53突變的關(guān)系。第二部分：體外培養(yǎng)HCT116 p53-/-細(xì)胞系，分6組：①Ras單轉(zhuǎn)染組；②RasV12單轉(zhuǎn)染組；③RasN17單轉(zhuǎn)染組；④Ras+Ad-p53組；⑤RasV12+Ad-p53組；⑥R

4、asN17+Ad-p53組；培養(yǎng)HCT116 p53-/-細(xì)胞系密度達(dá)60%后，經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及病毒感染24小時(shí)，奧沙利鉑處理12小時(shí)。利用Calcein/PI熒光原位分析不同處理對(duì)細(xì)胞凋亡水平的影響；應(yīng)用MTT法檢測奧沙利鉑作用下細(xì)胞存活率；提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后實(shí)時(shí)定量PCR分析凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；提取細(xì)胞總蛋白，通過WB法檢測奧沙利鉑作用下各組中Bax、Bcl-2、p53和Ras等基因相關(guān)蛋白表達(dá)情

5、況。
　　結(jié)果：1.收集67對(duì)結(jié)直腸癌患者的癌組織和癌旁組織，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增K-Ras和p53基因，測序檢測突變情況發(fā)現(xiàn)：K-Ras第12個(gè)氨基酸突變率最高，在癌組織中達(dá)到25.37%（17/67），癌旁組織中突變顯著低于癌組織為14.9%（10/67）（p<0.01）；第13個(gè)氨基酸突變率也較高，癌組織和癌旁組織中分別為10.45%（7/67）和2.99%(2/67)（p<0.01）；第17個(gè)氨基酸突變率最低，僅有1

6、個(gè)患者癌組織和癌旁組織發(fā)生第17位氨基酸的突變（p>0.05）；p53基因的236位點(diǎn)突變率在癌組織中為10.45%（7/67），癌旁組織中為5.97%（4/67）（p<0.05）；249位點(diǎn)突變率在癌組織中為20.9%（14/67），癌旁組織中為11.94%（8/67）（p<0.05）；應(yīng)用秩相關(guān)性分析K-Ras突變與p53突變之間無顯著相關(guān)性。2.通過Calcein-AM/PI染色我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)p53缺失時(shí)，Ras單轉(zhuǎn)染組、RasV1

7、2單轉(zhuǎn)染組、RasN17單轉(zhuǎn)染組的凋亡率分別為（8.3±1.5）%、(16.8±1.7)%、(4.4±1.6)%，其中RasV12單轉(zhuǎn)染組凋亡率明顯高于其他兩組，這提示我們在L-OHP藥物作用下，RasV12突變顯著提高了細(xì)胞凋亡率；當(dāng)p53高表達(dá)時(shí)，Ras+Ad-p53、RasV12+Ad-p53、RasN17+Ad-p53凋亡率分別為(13.5±1.9)%、(25.9±2.2)%、(7.6±1.2)%，RasV12+Ad-p53組凋

8、亡率最高，而對(duì)比于p53缺失的三組，p53高表達(dá)的三組凋亡率明顯增高，這說明L-OHP藥物作用下Ras與p53具有協(xié)同增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡的作用。3.為了證實(shí)Calcein-AM/PI染色結(jié)果，我們又應(yīng)用了MTT法檢測奧沙利鉑作用下各種細(xì)胞的存活數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， RasN17轉(zhuǎn)染組、Ras轉(zhuǎn)染組、RasV12轉(zhuǎn)染組、RasN17+p53組、Ras+p53組、RasV12+p53組六組的平均OD值分別為0.875、0.769、0.647、0.4

9、82、0.316、0.247，細(xì)胞相對(duì)存活率分別為93.3%，82.0%，69.0%，51.4%，33.7%，26.3%。4.隨后我們通過免疫印記結(jié)果來進(jìn)一步證實(shí)，Ras+Ad-p53、RasV12+Ad-p53、RasN17+Ad-p53三組的凋亡蛋白Bax表達(dá)水平均高于Ras單轉(zhuǎn)染組、RasV12單轉(zhuǎn)染組、RasN17單轉(zhuǎn)染組，驗(yàn)證了Ras與p53具有協(xié)同增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的作用， Bcl-2的表達(dá)水平則與Bax結(jié)果相反；而在Ras+Ad

10、-p53、RasV12+Ad-p53、RasN17+Ad-p53三組中， RasV12+Ad-p53組的Bax表達(dá)水平最高，Ras+Ad-p53組次之，RasN17+Ad-p53最低， Bcl-2的表達(dá)水平則與Bax結(jié)果相反。5.最后，我們通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR來表明， p53高表達(dá)與缺失條件下，RasV12轉(zhuǎn)染組Bax mRNA表達(dá)水平均顯著高于Ras轉(zhuǎn)染組和RasN17轉(zhuǎn)染組，且p53高表達(dá)時(shí)較p53缺失時(shí)表達(dá)水平明顯增高。