PDGFR-a在C57BL-6J小鼠體外腭突懸浮培養(yǎng)融合過程中的表達(dá)變化.pdf

1、目的：有研究證實(shí)，在斑馬魚頜面部發(fā)育過程中，血小板衍生生長因子受體α（platelet-derived growth factor receptorα,PDGFR-α）與腭裂關(guān)系密切。在人類胎兒酒精綜合征（Fetal Alcohol Spectrum Disorder，F(xiàn)ASD）患者中進(jìn)行血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）的基因組測序，數(shù)據(jù)表明PDGFR-α與FASD的顱面部表型

2、密切相關(guān)，證實(shí)了PDGFR-α與顱面部發(fā)育機(jī)制相關(guān)。而PDGFR-α因子與先天性腭裂之間的關(guān)系研究至今鮮有報道。前期實(shí)驗(yàn)研究了正常小鼠胚胎腭突發(fā)育過程中，PDGFR-α在腭突內(nèi)的時空表達(dá)變化。本實(shí)驗(yàn)擬以C57BL/6J小鼠為模型，進(jìn)行小鼠腭突器官體外懸浮培養(yǎng)模型的構(gòu)建，研究PDGFR-α因子在小鼠腭突體外旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)下不同時間段的表達(dá)變化。
　　方法：體式顯微鏡下進(jìn)行腭突取材，應(yīng)用懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)腭突。分別培養(yǎng)24、36、48小時，取出

3、腭突甲醛固定后體視顯微鏡下觀察并記錄腭突發(fā)育情況，蘇木素-伊紅（HE）觀察腭突不同發(fā)育時間段情況，運(yùn)用免疫組織化學(xué)檢測腭突體外培養(yǎng)不同時間段組織中PDGFR-α蛋白的表達(dá)定位；Western blotting檢測腭突體外培養(yǎng)不同時間段組織中PDGFR-α蛋白的時空表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.體視顯微鏡和蘇木素-伊紅（HE）染色結(jié)果均顯示，在改進(jìn)的體外腭突懸浮培養(yǎng)方法下，體外培養(yǎng)24h腭突與GD13.5天時相比較，雙側(cè)腭突

4、向中線方向靠近生長；36h時，鏡下觀察到雙側(cè)腭突融合，HE切片觀察到中嵴上皮縫的形成；48h時，HE觀察到中嵴上皮縫消失，表明體外培養(yǎng)腭突完全融合。
　　2.免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示PDGFR-α在小鼠體外培養(yǎng)的腭突間充質(zhì)和上皮中都有表達(dá)，在體外培養(yǎng)24h后，即相當(dāng)于GD14.5天時，表達(dá)水平達(dá)到高峰，與前期實(shí)驗(yàn)體內(nèi)正常發(fā)育的腭突的PDGFR-α表達(dá)水平變化一致；并與體外腭突培養(yǎng)的36h、48h蛋白表達(dá)水平相對比有明顯的差異。

5、r>　　3. Western blotting方法檢測PDGFR-α在腭突體外懸浮培養(yǎng)不同時間段的蛋白表達(dá)變化和免疫組化檢測結(jié)果趨勢一致；并與前期體內(nèi)正常發(fā)育階段PDGFR-α在不同時間段內(nèi)蛋白表達(dá)趨勢近似。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過改進(jìn)的體外懸浮培養(yǎng)腭突方法為研究腭裂發(fā)病機(jī)制提供了一個良好的體外腭突培養(yǎng)模型；PDGFR-α在體外培養(yǎng)腭突發(fā)育的關(guān)鍵時期均有表達(dá)，而且與前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比較具有相似性。良好的體外模型的建立為后續(xù)腭裂發(fā)病復(fù)雜