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文檔簡介
1、目的:從SFRP4/Wnt/β-catenin/FoxO3a/p27通路的角度,研究熊果酸(UA)對AngⅡ誘導A7r5細胞增殖的抑制作用。
方法:復制SD大鼠高脂血癥模型,免疫組化技術檢測其胸主動脈壁SFRP4的蛋白表達;復制 AngⅡ(0.1μM)誘導的A7r5細胞增殖模型,實驗分組為:正常對照組,AngⅡ模型組,UA組(5μM,10μM,20μM),UA組均預給藥12h后加入AngⅡ造模24h,CCK-8法檢測該時間點細
2、胞增殖活性;RT-PCR和western blot技術檢測各組細胞SFRP4、β-catenin、FoxO3a、p27的mRNA和蛋白水平;免疫熒光技術觀測β-catenin的胞內(nèi)定位;首次應用RNA干擾技術,驗證A7r5細胞通路級聯(lián)關系及UA的作用靶標,設計分組:AngⅡ模型組、模型+si-SFRP4組、模型+Wnt通路抑制劑XAV939(5μM,預孵育4h)組、UA組(20μM)、UA+si-SFRP4組、UA+Wnt通路激活劑Li
3、Cl(500μM,預孵育4h)組;Western blot技術檢測干擾效率和目的蛋白表達;采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
結果:①動物學研究:免疫組化技術結果顯示,大鼠胸主動脈壁存在SFRP4蛋白,且正常組的SFRP4光密度比值高于模型組(P<0.05);②細胞學研究:CCK-8結果顯示,0.1μM AngⅡ誘導24h顯著提高細胞增殖率,而分別加入5μM、10μM、20μM UA預保護12h,均有明顯的細胞增殖抑制作
4、用(P<0.05);模型+si-sFRP4組的增殖率較模型組升高,且UA+si-SFRP4組增殖率較UA組增高(P<0.05),提示SFRP4與該細胞增殖呈負相關,且隨SFRP4表達減少,UA的抗增殖活性減弱。模型組的SFRP4、FoxO3a、p27的mRNA和蛋白水平較正常對照組均下降,F(xiàn)oxO3a蛋白磷酸化水平升高,且β-catenin的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05),免疫熒光結果顯示,β-catenin蛋白表達核內(nèi)增多,提
5、示AngⅡ誘導Wnt/β-catenin通路的激活;加入si-SFRP4后,模型組SFRP4蛋白表達缺失,β-catenin蛋白表達升高(P<0.05),提示SFRP4負性調(diào)控β-catenin;與模型組相比,模型+XAV939組β-catenin、p-FoxO3a蛋白表達下調(diào),F(xiàn)oxO3a、p27表達增多(P<0.01),提示FoxO3a、p27受上游分子β-catenin的調(diào)控,綜上即A7r5細胞增殖中存在SFRP4/Wnt/β-c
6、atenin/FoxO3a/p27信號軸的調(diào)控。UA組SFRP4、FoxO3a、p27的mRNA水平和蛋白表達均較模型組升高,β-catenin的mRNA和蛋白水平下降,β-catenin蛋白的核內(nèi)表達顯著減少,p-FoxO3a表達下調(diào)(P<0.05),提示UA可抑制Wnt通路的激活,上調(diào)下游轉錄因子;經(jīng)si-SFRP4處理后,UA組SFRP4蛋白表達沉默,β-catenin的蛋白表達升高(P<0.05),提示UA抑制Wnt通路涉及到上
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