斑鱖胃蛋白酶原及相關(guān)基因的克隆與組織表達特征.pdf

1、采用分子克隆技術(shù)首次獲得了斑鱖（Siniperca scherzeri）3種胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）：PGA1、PGA2和PGC，PGA1和PGC5'側(cè)翼區(qū)序列以及胃質(zhì)子泵（gastricH+/K+-ATPase）α、β亞基的基因序列，分析了它們在鰓、食道、胃、幽門垂、前腸、后腸、肝胰臟、腎臟、脾臟、心臟、皮膚、肌肉、卵巢和精巢各組織中表達特征，為進一步研究不同PG的時空表達、功能、激活及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定了分子基礎(chǔ)，為魚類

2、消化生理的分子機制研究提供了新的資料。 采用RT-PCR和RACE等技術(shù)克隆了斑鱖3種PG基因（PGA1、PGA2和PGC）cDNA全長序列和DNA序列，結(jié)果表明：PGA1cDNA全長序列1361bp，共編碼378個氨基酸；PGA2cDNA全長序列1348bp，編碼376個氨基酸；PGCcDNA全長序列1505bp，編碼387個氨基酸。3種PG的氨基酸序列均由信號肽、激活肽和胃蛋白酶3個部分組成，序列中含有催化活性必需的2個天冬

3、氨酸殘基和構(gòu)成二硫鍵的6個半胱氨酸殘基。斑鱖PGA1與其它魚類的PGA氨基酸序列相似度在77.8％～94.2％之間，與兩棲類、鳥類以及哺乳類則在68.8％～74.4％之間；斑鱖PGA2與其它魚類的PGA氨基酸序列相似度在77.9％～95.5％之間，與兩棲類、鳥類以及哺乳類則在68.5％～72.5％；斑鱖PGC與其它魚類的PGC氨基酸序列相似度在89.1％～92.0％之間，與兩棲類、鳥類以及哺乳類則在67.3％～87.9％，斑鱖3種PG與

4、其它脊椎動物間的相似度較高（均大于60％），揭示了它們在進化過程中較為保守。PGA1、PGA2和PGC的DNA序列均由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成，除PGC第8內(nèi)含子剪切位點是GC-AG型外，其它均為GT-AG型。RT-PCR檢測了PGA1、PGA2和PGC在各組織中的表達情況，結(jié)果顯示：3種PG均在食道、胃和皮膚中表達，且主要在食道和胃中表達。此外PGA1還在心臟和精巢中表達，PGA2還在心臟、卵巢和精巢中表達，PGC還在肌肉中表達。

5、 為進一步探討斑鱖不同PG基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異，運用PCR-末端加尾法分別克隆獲得了長2437bp的PGA15'側(cè)翼區(qū)序列和長1924bp的PGC5'側(cè)翼區(qū)序列。結(jié)果顯示：PGA1和PGC的啟動子區(qū)域均位于-40～+10bp處，PGA1和PGC的啟動子區(qū)域均存在TATAbox，而無GCbox和CAATbox。在PGA15'側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)10個HSF和CdxA結(jié)合位點，在PGC5'側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)10個CdxA結(jié)合位點，此外還發(fā)現(xiàn)一些其它轉(zhuǎn)錄因

6、子結(jié)合位點。 由于胃酸的分泌是PG激活的必需條件，因此我們還克隆了斑鱖胃質(zhì)子泵α、β亞基的cDNA全長序列。結(jié)果顯示：α亞基cDNA全長3531bp，編碼1021個氨基酸，其氨基酸序列含有10個跨膜區(qū)，并存在1個賴氨酸/甘氨酸結(jié)構(gòu)簇和1個E1-E2型α亞基轉(zhuǎn)化的磷酸化位點；斑鱖胃質(zhì)子泵β亞基cDNA序列全長1742bp，編碼291個氨基酸，其氨基酸序列由胞質(zhì)域、膜域和胞漿域3個部分組成，且存在7個N-糖基化位點和6個位置較為保守

7、，形成二硫鍵的半胱氨酸。斑鱖胃質(zhì)子泵α亞基與其它魚類的相似度在92.8％～94.7％之間，與兩棲類和哺乳類的相似度在89.7％～93.2％之間；β亞基氨基酸序列與其它魚類的相似度在89.1％～92.1％之間，與兩棲類、鳥類和哺乳類的相似度在60.1％～67.7％之間，說明α、β亞基在脊椎動物長期的進化過程中具有較高的保守性。斑鱖胃質(zhì)子泵α亞基和β亞基均在食道、胃中有大量表達。其中α亞基除不在肝胰臟和卵巢中表達外，在其它所檢測的組織中均表