利用鋅指核酸酶敲除斑馬魚目的基因的實(shí)驗(yàn)體系的初步構(gòu)建.pdf

1、斑馬魚因其個(gè)體小、易于飼養(yǎng)、性成熟周期短、體外受精和發(fā)育、易繁殖且繁殖率高、胚體透明容易觀察、便于胚胎操作等優(yōu)勢,現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于基因功能相關(guān)研究。近年來在基因功能研究和疾病的基因治療方面,基因組定點(diǎn)突變逐漸成為反向遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn),具有廣闊的應(yīng)用前景。在小鼠中通過同源重組進(jìn)行基因敲除研究基因功能的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟了,但是在其它低等脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中,還沒有成熟的基因敲除技術(shù)。目前可以應(yīng)用于斑馬魚的反向遺傳學(xué)技術(shù)很有限,主要有TIL

2、LING技術(shù)、RNAi技術(shù)和Morpholinos技術(shù)。但是這些技術(shù)都不能獲得斑馬魚目的基因敲除突變體,因而限制了斑馬魚反向遺傳學(xué)的研究。
　　 鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)包括兩個(gè)部分,即鋅指蛋白(zinc fingerprotein,ZFP)結(jié)構(gòu)域和FokⅠ結(jié)構(gòu)域,其中ZFP負(fù)責(zé)與特異性的核酸序列結(jié)合,而切割結(jié)構(gòu)域FokⅠ對DNA進(jìn)行切割,形成DNA序列雙鏈斷裂。ZFN可使生物體通過非同源末

3、端連接在斷裂處產(chǎn)生突變,有望成為斑馬魚等生物基因敲除的得力工具。
　　 本課題主要以斑馬魚為模式生物,以小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子a(microphthalmia-associate transcription factor a,mitfa)基因?yàn)榘形稽c(diǎn),構(gòu)建操作簡便切實(shí)可行的目的基因敲除實(shí)驗(yàn)體系。首先,選擇斑馬魚mitfa基因DNA序列的第2965bp～2988bp為靶位點(diǎn),并設(shè)計(jì)一對特異性識別靶位點(diǎn)DNA序列的鋅指蛋白

4、。第二步,利用DNAWorks針對每一個(gè)ZFP設(shè)計(jì)出14條序列,通過兩步法PCR合成ZFPs的編碼序列276bp。第三步,將ZFPs的編碼序列與切割結(jié)構(gòu)域FokⅠ連接到表達(dá)載體PET-30a構(gòu)成帶組氨酸標(biāo)簽的ZFNs。第四步,利用Escherichia coli在22℃,0.3mM IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)可溶性ZFNs,通過組氨酸親和柱純化ZFNs并利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。第五步,在25℃下,體外檢測到ZFNs具有切割靶位點(diǎn)DNA的能

5、力。最后,將ZFNs導(dǎo)入斑馬魚體內(nèi),獲得了一條攜帶mitfa突變基因的斑馬魚,突變發(fā)生在斑馬魚mitfa基因第2977bp～2979bp。
　　 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系中,我們首次引入DNAWorks和兩步法PCR,極大地簡化了ZFPs的DNA序列合成步驟;在體外表達(dá)ZFNs時(shí),通過培養(yǎng)基優(yōu)化獲得了更多的可溶性ZFNs,簡化了ZFNs的純化過程;在斑馬魚體內(nèi)進(jìn)行目的基因敲除過程中,采用CMV啟動(dòng)子,增強(qiáng)了ZFNs表達(dá)的廣泛性。通過系統(tǒng)研