家蠶農(nóng)核病毒BmDNV-1熒光假病毒粒子的制備及人博卡病毒VP2的純化.pdf

1、導(dǎo)致人類疾病的病原體在不斷進(jìn)化，人類生產(chǎn)方式和生活環(huán)境的巨大演變也加速著這一進(jìn)化過程。新病毒以及新型疾病的出現(xiàn)給人類生命健康和傳統(tǒng)疾病治療手段帶來了前所未有的挑戰(zhàn)，如2003年在亞洲急劇流行的嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)、2009年席卷全球的甲型流感病毒(H1N1、H5N1)和2005年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)小病毒科人博卡病毒(HBoV)等。在眾多威脅人類健康的疾病之中，惡性腫瘤(又稱癌癥)依舊占據(jù)著主要地位，并且尚無切實可行的治療方法。

2、>　　 尋找可行的癌癥治療手段和方法，已經(jīng)引起了醫(yī)學(xué)界和科學(xué)界的密切關(guān)注，人們不斷探索著一些新的治療方法。相對于傳統(tǒng)癌癥治療手段(化療、放療)所帶來的嚴(yán)重副反應(yīng)特性，近年來出現(xiàn)的生物納米技術(shù)在癌癥治療方面展現(xiàn)出了巨大潛力和優(yōu)勢。納米生物技術(shù)是運用一些納米顆粒或類似于納米顆粒的生物材料(如病毒樣顆粒)作為載體平臺，來實現(xiàn)對病變等非正常細(xì)胞的特異性進(jìn)攻，以達(dá)到治療疾病的目的。目前，有關(guān)病毒樣顆粒在細(xì)胞內(nèi)或生物機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑與機(jī)制、病毒樣

3、顆粒體外去組裝與重組裝、生物效應(yīng)分子的偶聯(lián)與包被等特性尚不夠清楚。
　　 本研究基于已有有關(guān)細(xì)小病毒的研究，體外構(gòu)建家蠶濃核病毒伊那株(BmDNV-1)結(jié)構(gòu)蛋白基因vp4與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白egfp基因融合表達(dá)載體，利用重組桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)，制備熒光病毒樣顆粒(fluorescent virus-likeparticle，fVLP)。得到的熒光病毒樣顆粒因攜帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記，可以方便地用于其入胞、轉(zhuǎn)運、定位以及體外自組裝

4、等生物學(xué)特性研究，為有關(guān)癌癥治療藥物的研發(fā)提供參考。另外，以人博卡病毒(Human Bocavirus，HBoV-1)結(jié)構(gòu)蛋白VP2為研究對象，構(gòu)建VP2原核表達(dá)載體，親和純化VP2蛋白，用于多克隆抗體制備，用于人博卡病毒的快速檢測和病毒蛋白亞細(xì)胞定位研究。
　　 完成的工作包括以下幾個方面：
　　 1.制備家蠶濃核病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP4與EGFP融合表達(dá)的熒光病毒樣顆粒
　　 1)PCR分別體外擴(kuò)增家蠶濃核病毒結(jié)構(gòu)

5、蛋白基因。vp4和綠色熒光蛋白egfp基因，通過酶切、連接和轉(zhuǎn)化等步驟篩選重組克隆。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac，在協(xié)助質(zhì)粒的幫助下，構(gòu)建含結(jié)構(gòu)基因vp4和egfp基因融合表達(dá)的重組Bacmid。
　　 2)重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生重組桿狀病毒，獲得重組桿狀病毒病毒液。以最適感染復(fù)數(shù)的病毒液感染hi5細(xì)胞以表達(dá)熒光病毒樣顆粒EGFP-VP4fVLP，然后利用蔗糖墊層及CsCl梯度離心獲得較純凈的fVLP

6、，電鏡觀察。
　　 2.表達(dá)并純化HBoV-1結(jié)構(gòu)蛋白VP2
　　 1)PCR擴(kuò)增HBoV結(jié)構(gòu)蛋白基因vp2，并將其分別連接到pET-28a(+)和pMAL-c2x原核表達(dá)載體上，獲得原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a(+)-VP2和pMAL-c2x-VP2，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)表達(dá)宿主菌，檢測目的蛋白VP2表達(dá)情況。
　　 2)將不同分子伴侶導(dǎo)入重組表達(dá)菌，檢測目的蛋白的可溶性及表達(dá)情況，利用親和樹脂純化VP2蛋