紫草素對哮喘氣道炎癥和氣道重塑的影響及其機制研究.pdf

1、目的:
　　本研究旨在探討紫草素治療對慢性哮喘模型小鼠氣道炎癥、氣道重塑的影響及對PDGF誘導的AMSCs增殖、遷移的影響，并對其機制進行初步的探討，為紫草素治療哮喘提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　一、紫草素對慢性哮喘模型小鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響
　?。ㄒ唬┞韵Ｐ椭谱?br>　　按照BALB/c小鼠慢性哮喘模型制作方法，在實驗的笫1d、8d、15d每只小鼠腹腔注射含有卵蛋白100μg、氫氧化鋁凝膠1mg

2、的致敏液共0.2ml致敏，第22d開始霧化吸入1％卵蛋白誘發(fā)小鼠喘息發(fā)作，隔日一次（每周3次），共霧化激發(fā)8周。
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　　選擇同體重，體重為18-20g，同周齡，年齡為4-6周的BALB/c雌性小鼠共36只，動物先于我院SPF級實驗室中飼養(yǎng)1周，以適應周圍環(huán)境，再隨機分為6組進行實驗。按不同的影響因素進行分別研究。其中正常對照組6只、哮喘模型組6只、紫草素低劑量組(0.5mg/kg)6只、紫草素中等劑量組(2mg

3、/kg)6只、紫草素高劑量組(4mg/kg)6只、地塞米松治療（陽性對照）組6只。
　　正常對照組:卵蛋白吸入改為生理鹽水霧化吸入;
　　哮喘模型組:與哮喘模型制作的過程一致;
　　紫革素低劑量（0.5mg/kg）組:卵蛋白給藥致敏、誘喘同哮喘模型組。致敏第22d開始，在霧化吸入卵蛋白前1小時給予每只小鼠紫草素0.5mg/kg腹腔注射;
　　紫草素中劑量(2mg/kg)組:卵蛋白給藥致敏、誘喘同哮喘模型組。致敏第

4、22d開始，在霧化吸入卵蛋白前1小時給予每只小鼠紫草素2mg/kg腹腔注射;
　　紫草素高劑量(4mg/kg)組:卵蛋白給藥致敏、誘喘同哮喘模型組。致敏第22d開始，在霧化吸入卵蛋白前1小時給予每只小鼠紫草素4mg/kg腹腔注射;
　　地塞米松治療（陽性對照）組:卵蛋白給藥致敏、誘喘同哮喘模型組。致敏第22d開始，在霧化吸入卵蛋白前1小時給予每只小鼠地塞米松2mg/kg腹腔注射;
　　二、紫草素對PDGF誘導的氣道平滑

5、肌細胞增殖、遷移的影響
　　（一）細胞培養(yǎng)及鑒定
　　SD大鼠麻醉后左心室取血處死。分離大鼠氣管，注意無菌操作，剝離氣管壁外膜，用棉簽于內(nèi)膜處輕輕擦拭幾下以去除內(nèi)膜。食管與氣管相連接處的氣管上有一小條無軟骨環(huán)的肌肉組織，此處即為氣道平滑肌組織，用眼科剪將其小心剪下，含雙抗的DMEM培養(yǎng)液清洗后將平滑肌條剪碎。用0.1％胰酶于37℃水浴震蕩10min，1000r/min離心5min，去上清。后于37℃水浴下采用0.1％Ⅳ型膠原

6、酶消化30min，1000r/min離心5min，此步驟重復2次。加入含10％胎牛血清的DMEM終止消化，輕輕吹打重懸細胞后200目濾網(wǎng)過濾后接種至50ml培養(yǎng)瓶37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)。3d換液，7d長滿培養(yǎng)瓶。用0.25％胰蛋白酶消化傳代后，利用成纖維細胞貼壁較快的特點純化平滑肌細胞，取第4代細胞用于檢測。α-SMA免疫熒光法鑒定氣道平滑肌細胞。
　　（二）細胞處理及分組
　　細胞毒性分析，根據(jù)MTT結(jié)果，選取對細胞毒性

7、小的紫草素干預濃度0.3、1μM用于后續(xù)實驗。
　　結(jié)果:
　　一、紫草素對慢性哮喘模型小鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響
　　在給予乙酰甲膽堿激發(fā)后，哮喘模型組的Penh值高于正常對照組(P＜0.05);應用不同劑量的紫草素及地塞米松干預均可使Penh值較哮喘組下降，且紫草素對Penh升高的抑制作用呈劑量依賴性(P＜0.05)，高劑量紫草素組的Penh值較低劑量紫草素下降(P＜0.05);在Mch激發(fā)濃度為3.125、6.

8、25、12.5mg/ml時，地塞米松組對Penh的抑制作用顯著高于紫草素高劑量干預組(P＜0.05)，但Mch激發(fā)濃度升高至25mg/ml、50mg/ml時，地塞米松組與紫草素高劑量組小鼠Penh值比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　二、紫草素對PDGF誘導氣道平滑肌細胞增殖、遷移的影響
　　1、紫草素對PDGF誘導的ASMCs增殖的影響:與正常ASMCs培養(yǎng)組相比，PDGF誘導組的ASMCs在實驗的12、24、48小時

9、細胞增殖水平顯著提高(P＜0.01);在實驗的24、48小時，0.3μM紫草素能有效抑制PDGF誘導的ASMCs增殖(P＜0.05)，1μM紫草素能顯著抑制PDGF誘導的ASMCs增殖（P＜0.01）。
　　2、紫草素對PDGF誘導的ASMCs細胞周期變化的影響:與正常對照組相比，PDGF組ASMCs細胞處于G0/G1期的比例顯著下降(P＜0.01)，而處于G2/M期的細胞比例顯著升高(P＜0.01);0.3μM、1μM紫草素干預

10、可以逆轉(zhuǎn)PDGF誘導的ASMCs細胞周期改變(P＜0.01)，而1μM紫草素較0.3μM紫草素干預逆轉(zhuǎn)PDGF誘導ASMCs細胞周期改變的作用更顯著(P＜0.05)。
　　3、紫草素對PDGF誘導的ASMCs細胞遷移的影響:對照組ASMCs遷移數(shù)量較少，與對照組相比，PDGF誘導組細胞在實驗的12、24、48小時遷移數(shù)量顯著增多(P＜0.01);在實驗的24、48小時，0.3μM紫草素能有效抑制PDGF誘導的ASMCs遷移(P＜0

11、.05)，1μM紫草素能顯著抑制PDGF誘導的ASMCs遷移(P＜0.01)。
　　三、紫草素抑制哮喘氣道炎癥及氣道重塑的分子機制研究
　　1、紫草素對ERK1/2信號通路活化的影響
　　在肺組織中，哮喘模型組肺組織中的ERK磷酸化水平明顯增高(P＜0.01);在細胞中，PDGF誘導組的ERK磷酸化水平明顯增高（P＜0.01）。在肺組織中，給予不同濃度的紫草素、地塞米松干預后，肺組織中的ERK1/2磷酸化水平隨紫草素濃

12、度的升高而顯著降低(P＜0.01)，高劑量紫草素與地塞米松干預組抑制ERK1/2磷酸化水平無差異(P＞0.05);
　　2、紫草素對NF-κB信號通路活化的影響
　　在細胞實驗中，PDGF誘導組的IκBα、p-IκBα及胞漿和胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達變化與哮喘模型組肺組織中的蛋白表達改變趨勢一致，而紫草素處理后可逆轉(zhuǎn)PDGF誘導引發(fā)的IκBα、p-IκBα及胞漿和胞核內(nèi)的NF-κB p65蛋白表達改變，與PDGF誘導

13、組比較，1μM紫草素處理細胞后IκB的蛋白表達升高（P＜0.05），p-IκB的蛋白表達顯著下降(P＜0.01)，而胞漿NF-κBp65蛋白表達顯著升高（P＜0.01），胞核NF-κB p65蛋白表達顯著減低(P＜0.01)。
　　在細胞實驗中，正常對照組NF-κB主要分布于ASMCs的細胞漿中。在PDGF誘導的ASMCs中，NF-κB的亞細胞分布由細胞漿部分轉(zhuǎn)移至細胞核中，而0.3μM、1μM紫草素處理能夠抑制PDGF誘導的NF

14、-κB分布轉(zhuǎn)移。
　　3、紫草素與信號通路抑制劑對ASMCs增殖、遷移以及ERK1/2/NF-κB信號通路活化影響的比較
　　在細胞實驗中，當單獨給予紫草素、聯(lián)應用紫草素和PD98059處理時，抑制ASMCs增殖、細胞周期變化及細胞遷移的作用均較單獨應用PD98059處理時更顯著（P＜0.01）。當單獨給予紫草素、聯(lián)應用紫草素和PDTC處理時，抑制ASMCs增殖、細胞周期變化及細胞遷移的作用均較單獨應用PDTC處理時更顯著（

15、P＜0.05）。
　　在細胞實驗中，聯(lián)合應用紫草素和通路阻滯劑(PD98059或PDTC)比單獨應用紫草素或通路阻滯劑（PD98059或PDTC）對抑制p-ERK1/2、p-IκBα蛋白表達及NF-κB核內(nèi)移的作用更顯著(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、紫草素能夠降低慢性哮喘模型小鼠的氣道高反應性;
　　2、紫草素能夠抑制慢性哮喘模型小鼠的氣道炎癥及黏液高分泌狀態(tài);
　　3、紫草素可降低哮喘小鼠BAL

16、F中IL-4、IL-5水平，推測其可能是通過抑制Th2細胞反應發(fā)揮作用。
　　4、紫草素能夠減少慢性哮喘模型小鼠氣道周圍膠原形成，降低肺組織中羥脯氨酸含量，下調(diào)哮喘氣道重塑時經(jīng)典標志物α-SMA、MMP-9的表達，從而發(fā)揮抑制哮喘模型中氣道重塑的作用。
　　5、紫草素能夠抑制PDGF誘導的ASMCs異常增殖;
　　6、紫草素可通過對ASMCs細胞周期的調(diào)控抑制PDGF誘導的細胞異常增殖;
　　7、紫草素能夠抑制P

17、DGF誘導的ASMCs細胞遷移。
　　8、ERK1/2/NF-κB信號通路活化參與了OVA誘導的哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑，紫草素干預可能通過抑制ERK1/2/NF-κB信號通路激活，發(fā)揮抑制哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑的作用。
　　9、ERK1/2/NF-κB信號通路活化參與PDGF誘導的ASMCs增殖、遷移過程，紫草素干預可能通過抑制ERK1/2/NF-κB信號通路激活，發(fā)揮抑制ASMCs異常增殖、遷移的作用。