OCT4A選擇性剪接體對人牙髓干細胞自我更新能力的調控作用.pdf

1、利用干細胞的特性進行組織工程修復缺損器官是再生醫(yī)學研究的熱點，牙髓干細胞（human dental pulp stem cell，hDPSCs）取材簡單，創(chuàng)傷小，是非常有應用價值的組織工程種子細胞。但研究發(fā)現(xiàn)其數(shù)量較少，體外培養(yǎng)擴增能力有限，增殖率低于胚胎干細胞，難以達到組織工程所需的細胞數(shù)量，有報道體外培養(yǎng)的hDPSCs“干性”特征隨傳代次數(shù)增加而減弱[1]。因此搞清牙髓干細胞自我更新的調控機制，找到調控其“干性維持”的靶點，將有助于

2、解決牙髓干細胞應用的瓶頸問題。
　　我們的前期研究發(fā)現(xiàn)OCT4轉錄因子一個重要的選擇性剪接體——OCT4A的表達下調與hDPSCs體外擴增后干性特征降低密切相關，此外與胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）相比hDPSCs內OCT4A表達量較低，以上結果提示OCT4A剪接體可能參與調控hDPSCs自我更新能力。
　　研究證實OCT4轉錄因子作為干細胞的多能性的標記物，參與維持ESCs和成體干細胞（A

3、dult stem cells，ASCs）的干性特征。其pre-mRNA可被選擇性剪接產生OCT4A、OCT4B、OCT4B1三個主要亞型，其中OCT4A亞型決定干細胞的多能性。而TIP110（squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells3）作為一種剪切因子，參與調節(jié)OCT4A mRNA的剪接。
　　本研究擬利用shRNA和高表達慢病毒載體研究OCT4A在hDPSCs干

4、性維持中的調控作用，同時檢測hDPSCs內TIP110對OCT4A表達調控，并探究TIP110對hDPSCs增殖、自我更新能力的影響；最后通過裸鼠體內移植實驗進一步驗證OCT4A和TIP110對hDPSCs的調控作用，為進一步研究通過TIP110調節(jié)OCT4A剪接體表達以調控hDPSCs多潛能性和自我更新能力奠定基礎，并為研究hDPSCs干性維持機制以及組織工程臨床應用提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法和結果：
　　1.hD

5、PSCs分離、培養(yǎng)和鑒定
　　采用組織塊聯(lián)合酶消化法成功分離培養(yǎng)hDPSCs，通過檢測細胞表面抗原及多向分化能力，結果表明我們已成功分離、培養(yǎng)獲得hDPSCs。
　　2.OCT4A對hDPSCs自我更新能力的調控作用
　　體外二維條件下培養(yǎng)hDPSCs，并在P3代細胞利用shRNA和高表達慢病毒表達載體沉默和過表達OCT4A，分別檢測各組間在增殖、分化能力以及克隆形成能力和干性分子表達的差異。
　　結果顯示：

6、r>　　（1）通過CCK-8實驗檢測各組增殖能力，發(fā)現(xiàn)沉默OCT4A后hDPSCs的增殖能力被明顯抑制；過表達OCT4A后hDPSCs的增殖能力顯著增加。
　?。?）細胞克隆形成實驗（colony forming unit，CFU）檢測結果顯示沉默OCT4A后hDPSCs的克隆形成能力降低；而過表達OCT4A后hDPSCs的克隆形成能力增強。
　?。?）Real-Time PCR檢測各組hDPSCs中干性分子Klf4、Sox

7、2、Nanog、C-Myc的表達，發(fā)現(xiàn)在hDPSCs中沉默OCT4A后干性分子表達水平降低；過表達OCT4A則干性分子表達增強。
　?。?）成脂分化能力檢測結果顯示，油紅O染色后鏡下觀察可見沉默OCT4A后實驗組中形成的脂滴明顯少于對照組；Real-Time PCR檢測發(fā)現(xiàn)沉默OCT4A后實驗組中PPARγ的表達受到了明顯抑制；而過表達OCT4A可增加hDPSCs脂滴形成同時伴有成脂基因PPARγ的表達上調。
　?。?）礦化

8、能力檢測結果顯示，茜素紅染色后肉眼觀可見沉默OCT4A后實驗組染色強度明顯弱于對照組，過表達OCT4A后實驗組染色強度明顯強于對照組；Real-Time PCR和顯微鏡觀察可見沉默OCT4A可抑制鈣化結節(jié)的形成及成骨/成牙相關基因DSPP、BSP、OCN、ALP的表達；而過表達OCT4A則可促進hDPSCs鈣結節(jié)的形成和ALP、DSPP、OCN和BSP的表達。
　　體內移植實驗顯示將hDPSCs礦化誘導2周后接種于羥基磷灰石（HA

9、-TCP）支架材料上，植入裸鼠體內8周，Masson及免疫組化染色結果顯示沉默OCT4A后可抑制hDPSCs成骨/成牙向分化，過表達OCT4A則可促進成骨/成牙向分化，體內與體外結果一致。
　　3.TIP110對hDPSCs自我更新能力的調控作用
　　在hDPSCs中沉默TIP110后檢測各組間增殖、分化、克隆形成能力和干性分子之間的差異。
　　結果顯示：
　?。?）Real-Time PCR檢測沉默TIP110

10、后hDPSCs中干性分子表達水平，發(fā)現(xiàn)沉默TIP110后 Klf4、Sox2、Nanog、C-Myc表達受到抑制。
　　（2）CCK-8實驗結果顯示沉默TIP110后hDPSCs的增殖能力顯著降低。
　?。?）CFU實驗結果顯示沉默TIP110后實驗組中hDPSCs形成的克隆數(shù)目明顯少于對照組，表明沉默TIP110可抑制hDPSCs克隆形成能力。
　?。?）體外二維條件下誘導各組hDPSCs向成骨/成牙和成脂分化，通過

11、茜素紅和油紅O染色及Real-Time PCR檢測成骨/成牙及成脂相關基因，發(fā)現(xiàn)沉默TIP110后可明顯抑制hDPSCs的分化能力。
　?。?）Real-Time PCR檢測沉默TIP110后hDPSCs中OCT4剪接體（OCT4A,OCT4B和OCT4B1）表達水平，發(fā)現(xiàn)沉默TIP110后 OCT4A表達受到抑制，而OCT4B和OCT4B1表達無明顯改變。
　　綜上所述，本研究結果證實OCT4A在hDPSCs干性維持中發(fā)揮