FMRP參與前體mRNA的選擇性剪接調(diào)控及其在脆性X綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、【目的】脆性X綜合征（FXS）是常見(jiàn)的遺傳性智力低下疾病之一，其發(fā)病的主要原因是由于FMR1基因5′端非編碼區(qū)（C GG） n三核苷酸重復(fù)序列不穩(wěn)定擴(kuò)增及其相鄰部位CpG島異常甲基化使FMR1基因轉(zhuǎn)錄失活，導(dǎo)致其編碼的產(chǎn)物——脆性X智力低下相關(guān)蛋白F M RP表達(dá)減少或缺失而引起。該病的臨床表現(xiàn)包括發(fā)育遲滯，不同程度的智力低下、注意力缺陷、多動(dòng)癥及孤獨(dú)癥樣表現(xiàn)等。FMRP在腦組織中表達(dá)豐富，它作為一種選擇性RNA結(jié)合蛋白，能與大量mRN

2、 A結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控一系列mRN A的翻譯過(guò)程。過(guò)去已證實(shí) FMRP是一種多功能蛋白，從多種途徑參與基因的表達(dá)調(diào)控。本研究通過(guò)免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRP與選擇性剪接調(diào)控因子RBM14有直接相互作用。因此，推測(cè)FMRP通過(guò)與RBM14相互作用選擇性參與調(diào)節(jié)部分基因的選擇性剪接過(guò)程。本研究通過(guò)選定多個(gè)突觸可塑性相關(guān)基因作為靶基因，采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)FVB小鼠海馬組織及小鼠Neuro-2a細(xì)胞中各個(gè)靶基因剪接異構(gòu)體的

3、表達(dá)量。通過(guò)比較各個(gè)剪接異構(gòu)體表達(dá)含量的比值，以明確FMRP對(duì)各個(gè)靶基因中相關(guān)盒式外顯子的選擇性剪接調(diào)控作用。以期探索FM RP參與的選擇性剪接調(diào)控機(jī)制及其在 FXS病理生理過(guò)程中的可能作用，為進(jìn)一步闡明FXS發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1、利用FVB小鼠海馬組織進(jìn)行蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，聯(lián)合質(zhì)譜分析，檢測(cè)小鼠體內(nèi)FMRP相互作用蛋白的情況；
　　2、提取不同發(fā)育時(shí)期FVB小鼠海馬組織總蛋白、總RNA，

4、采用Western blot檢測(cè)Fmr1 WT鼠及KO鼠海馬組織中RBM14的表達(dá)情況，采用qRT-PCR檢測(cè)Fmr1 WT鼠及KO鼠海馬組織中各個(gè)靶基因剪接異構(gòu)體的表達(dá)量；
　　3、利用FMRP干擾、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及RBM14干擾表達(dá)質(zhì)粒（以及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后提取細(xì)胞總RNA，采用qRT-PCR檢測(cè)Neuro-2a細(xì)胞中各個(gè)靶基因剪接異構(gòu)體的表達(dá)量；
　　4、構(gòu)建Protrudin-L（

5、包含ExL）、Protrudin-S（Ex L缺失）、Tau-L（包含Ex10）、Tau-S（Ex10缺失）綠色熒光表達(dá)質(zhì)粒（以及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒），轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞后，經(jīng)反式-維甲酸誘導(dǎo)分化后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞突起生長(zhǎng)的情況。
　　【結(jié)果】
　　1、采用FVB小鼠海馬組織進(jìn)行CO-IP實(shí)驗(yàn)，聯(lián)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRP可結(jié)合RBM14，并通過(guò)Western blot得到驗(yàn)證；
　　2、在三個(gè)發(fā)育時(shí)期（E18、

6、P7、P60），F(xiàn)mr1 WT鼠與KO鼠海馬組織中RBM14的表達(dá)無(wú)明顯差異；在 E18、P60時(shí)期， Fmr1 KO鼠海馬組織中Protrudin-S/Protrudin-L比值上升，Tau-S/Tau-L比值下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在P7時(shí)期則均無(wú)明顯差異；NCAM-S/NCAM-L比值在三個(gè)時(shí)期均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　3、Neuro-2a細(xì)胞干擾表達(dá)FMRP或 RBM14后，Protrudin-S/Protrudin-L比

7、值上升，Tau-S/Tau-L比值下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NCAM-S/NCAM-L比值變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　4、Neuro-2a細(xì)胞過(guò)表達(dá) FMRP后，Protrudin-S/Protrudin-L比值下降， Tau-S/Tau-L比值上升，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NCAM-S/NCAM-L比值變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Neuro-2a細(xì)胞過(guò)表達(dá) FMRP，同時(shí)干擾表達(dá) RBM14后， Protrudin-S/Protrudin-

8、L、Tau-S/Tau-L和NCAM-S/NCAM-L比值變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　5、Protrudin-L、Protrudin-S、Tau-L、Tau-S綠色熒光表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后，Protrudin-L和Tau-S轉(zhuǎn)染組細(xì)胞突起顯著延長(zhǎng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　【結(jié)論】本研究首次證實(shí) FMRP通過(guò)與選擇性剪接相關(guān)蛋白 RBM14結(jié)合，參與pre-mRNA選擇性剪接過(guò)程，而且FMRP表達(dá)改變