選擇性抑制miR-221對卵巢癌細胞增殖、遷移能力的作用.pdf

1、目的：卵巢惡性腫瘤是女性生殖器常見的惡性腫瘤,因早期癥狀不典型且缺乏有效診斷方法，70％～80%卵巢癌患者晚期才被確診，但晚期尚無有效治療手段且易復發(fā),故卵巢惡性腫瘤的致死率位于婦科惡性腫瘤之首。上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占卵巢惡性腫瘤85%-90%，成為最常見的卵巢惡性腫瘤。
　　微小RNA(microRNA, miRNA)是一類小的非編碼RNA，通過降解mRNA或直接抑制翻譯過程

2、而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后負性調(diào)控作用。人們發(fā)現(xiàn)包括卵巢癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤中均有miR-221表達水平的異常升高，從而表明miR-221過表達與腫瘤的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。血清miR-221水平上調(diào)的EOC患者，其miR-221水平與國際婦產(chǎn)科協(xié)會EOC分期及腫瘤分級密切相關(guān)，血清中高表達miR-221是EOC獨立不良預后因素。相關(guān)研究顯示在人類肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中高水平的miR-221通過對直接靶基因如抑癌基因CDKN1B(p27kip1)、

3、CDKN1C(p57kip2)、MMAC1(PTEN)轉(zhuǎn)錄后負性調(diào)控而抑制細胞的凋亡，促進細胞增殖、遷移。目前有研究顯示miR-221在不同腫瘤中調(diào)控的直接靶基因不同，卵巢癌中miR-221的直接靶基因尚未有報道。但Wurz K等研究結(jié)果顯示大部分卵巢腫瘤細胞中p27和p57蛋白表達量減少，而且高表達miR-221和miR-222與低p57蛋白水平相關(guān)。相關(guān)研究表明下調(diào)結(jié)腸癌及膀胱癌中miR-221水平可抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋

4、亡。早期卵巢癌患者5年生存率近90%，晚期病人的5年生存率只有20%～30%但卵巢癌早期不易發(fā)現(xiàn)直至晚期已有廣泛轉(zhuǎn)移才被確診，卵巢癌患者仍有近80%復發(fā)，其中侵襲和轉(zhuǎn)移是導致卵巢癌患者復發(fā)的重要因素，故探究卵巢癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因及其作用，對阻止卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移具有十分重要的意義。miR-221作為致癌基因，在卵巢腫瘤細胞增殖、遷移中發(fā)揮著怎樣的作用？目前尚未見相關(guān)報道。是否可以通過選擇性抑制卵巢癌細胞中miR-221基因，阻遏

5、卵巢癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，以期望達到控制卵巢癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的目的。
　　本研究通過體外培養(yǎng)卵巢癌細胞SKOV3，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有miR-221sponge的質(zhì)粒，下調(diào)卵巢癌細胞SKOV3中miR-221的表達水平，觀察其對卵巢癌細胞SKOV3增殖、遷移能力的影響，從而研究miR-221在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為卵巢癌的治療提供新思路。
　　方法：
　　1.按照高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書中所示步驟提取兩種質(zhì)粒CAG-

6、EGFP-miR-221 sponge、CAG-EGFP,濃縮后測量質(zhì)粒濃度及純度。
　　2.將細胞分組：①實驗組(SKOV3-miR-221 sponge),應用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CAG-EGFP-miR-221 sponge；②陰性對照組(SKOV3-N),應用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CAG-EGFP；③空白對照組(SKOV3)，無處理。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染2

7、4h后細胞轉(zhuǎn)染情況。
　　3.Real-time PCR:用SYBRGreen法進行熒光實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染48小時后各組基因miR-221的表達量。
　　4.MTS法檢測各組SKOV3細胞0h、24h、48h、72h增殖能力。
　　5.細胞劃痕實驗：“十”字劃痕法評估各組SKOV3細胞的遷移能力。
　　6.統(tǒng)計方法：應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(X±S)表示，多組間均數(shù)比

8、較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。所有實驗重復三次。
　　結(jié)果：
　　1.鑒定質(zhì)粒CAG-EGFP-miR-221 sponge、CAG-EGFP的純度及濃度
　　兩種質(zhì)粒純度A260/A280為1.8，濃度在700ng/uL左右。
　　2.轉(zhuǎn)染效果的觀察
　　轉(zhuǎn)染CAG-EGFP-miR-221 sponge、CAG-EGFP24h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞有無綠色熒光，未轉(zhuǎn)染組無

9、熒光，說明轉(zhuǎn)染，觀察帶有綠色熒光細胞比例。結(jié)果顯示SKOV3-miR-221 sponge組轉(zhuǎn)染率為70%-80%，SKOV3-N組轉(zhuǎn)染率為60%-70%，SKOV3組無熒光表達。
　　3.Real-time PCR檢測各組miR-221的表達水平
　　實時定量PCR對各組細胞轉(zhuǎn)染后48小時后miR-221的表達水平：SKOV3-miR-221spong組1.172±0.025；SKOV3-N組1.852±0.019；SKO

10、V3組1.921±0.023；SKOV3-miR-221 sponge組與SKOV3-N組、SKOV3組相比，miR-221的表達量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05），SKOV3-N組與SKOV3組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　4.MTS法檢測各組細胞不同時間增殖情況
　　0小時：SKOV3-miR-221 sponge組0.344±0.0318，SKOV3-N組0.370±0.043，SKOV3組0

11、.390±0.047，實驗組與對照組相比P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義；
　　24小時：SKOV3-miR-221 sponge組0.421±0.068，SKOV3-N組0.510±0.041，SKOV3組0.561±0.059；SKOV3-miR-221 sponge組與SKOV3-N組相比P﹤0.05，差異有統(tǒng)計學意義，SKOV3-miR-221 sponge組與SKOV3組相比P﹤0.05，差異有統(tǒng)計學意義，SKOV3-N組

12、與SKOV3組相比P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義；
　　48小時：SKOV3-miR-221 sponge組0.518±0.0499，SKOV3-N組0.614±0.035，SKOV3組0.709±0.038，實驗組與對照組相比P﹤0.05，差異有統(tǒng)計學意義；
　　72小時：SKOV3-miR-221 sponge組0.5827±0.091，SKOV3-N組0.719±0.026，SKOV3組0.816±0.038，實驗組與

13、對照組相比P﹤0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　5.細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力
　　ImageJ軟件分析劃痕實驗結(jié)果，計算劃痕后24小時遷移率：SKVO3-miR-221 sponge組(17.39±5.28)%；SKOV3-N組(24.55±2.641)%；SKOV3組(21.01±3.74)%；實驗組與對照組比較P﹤0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　1.下調(diào)miR-221可顯著降低卵巢癌細